血液S腺苷同型半胱氨酸（SAH或AdoHcy）酶連續(xù)循環(huán)比色法定量檢測試劑盒

產(chǎn)品說明書

主要用途

血液S腺苷同型半胱氨酸（SAH或AdoHcy）酶連續(xù)循環(huán)比色法定量檢測試劑是一種旨在通過腺苷同型半胱氨酸核苷酶、腺嘌呤脫氨酶和黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)中生成過氧化氫，使用顯色染料和過氧化酶后，產(chǎn)生醌亞胺產(chǎn)物吸光峰值的變化，即采用比色法來測定血液裂解樣品中S腺苷同型半胱氨酸含量的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于動(dòng)物和人體血液樣品（血漿等）S腺苷同型半胱氨酸的定量檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

S腺苷同型半胱氨酸（S-adenosyl-L-homocysteine；SAH或AdoHcy），化學(xué)全稱為5’-S-(3-Amino-3-carboxy propyl)-5’-thioadenosine）是一碳代謝和細(xì)胞甲基化反應(yīng)的重要分子之一，也是半胱氨酸合成的中間產(chǎn)物。其分子量384.41，分子式為C₁₄H₂₀N₆O₅S。SAH對于甲基轉(zhuǎn)移酶具有高度的親和力。SAH通過S-腺苷甲硫氨酸（S-Adenosylmethionine；SAM或AdoMet）去甲基化產(chǎn)生。SAH是評價(jià)細(xì)胞甲基化潛力和代謝狀況的重要指標(biāo)。機(jī)體內(nèi)的SAH含量顯著低于SAM。一旦SAH含量升高，即SAM/SAH比例降低，則引起DNA甲基化不足，染色體構(gòu)像改變，抑制細(xì)胞甲基轉(zhuǎn)移酶活力，干擾同型半胱氨酸和腺嘌呤的清除，進(jìn)一步導(dǎo)致基因表達(dá)和信號傳導(dǎo)異常，以及免疫缺陷等。基于底物S腺苷同型半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine；AdoHcy），快速被腺苷同型半胱氨酸核苷酶（AdoHcy nucleosidase）分解為S-核糖同型半胱氨酸（S-ribosylhomo cysteine）和腺嘌呤（adenine），腺嘌呤由腺嘌呤脫氨酶（Adenine deaminase）產(chǎn)生次黃嘌呤，通過黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase）催化，生成過氧化氫，然后借助過氧化酶（peroxidase）的作用，與對羥基苯甲酸（p-hydroxybenzoic acid）和氨基安替比林（4-aminoantipyrine）反應(yīng)，形成有色醌亞胺（quinoneimine），通過其吸收峰值的變化（510nm波長），來定量分析S腺苷同型半胱氨酸的含量。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

保存方式

保存去干擾液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；底物液（Reagent C）避免光照；有效保證6月

用戶自備

抗凝管：用于血液采集的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器

微型臺式離心機(jī)：用于樣品操作

恒溫培養(yǎng)箱或水槽：用于反應(yīng)孵育

比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

• 樣品準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好肝素抗凝管
• 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血漿成分（注意：避免觸碰白色液體層）
• （選擇步驟）移取10微升進(jìn)行蛋白定量測定 
• 移取200微升血漿到新的1.5毫升離心管
• 加入xx微升去干擾液（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)冰槽里孵育30分鐘
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移取上清液到新的1.5毫升離心管
• 即刻置于冰槽里備用或放進(jìn)－70℃冰箱里保存

• 測定準(zhǔn)備

• 開啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長510nm，并置零 
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；底物液（Reagent C）避免光照
• 緩沖液（Reagent B）室溫下均衡溫度

• 背景對照測定

• 移取xx微升緩沖液（Reagent B）到新的比色皿
• 加入xx微升陰性液（Reagent E）
• 加入xx微升底物液（Reagent C）
• 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D） 
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 放進(jìn)37℃恒溫培養(yǎng)箱或水浴孵育20分鐘
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對照 

• 樣品測定

• 加入xx微升緩沖液（Reagent B）
• 加入20微升待測樣品（100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 加入xx微升底物液（Reagent C）
• 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 放進(jìn)37℃恒溫培養(yǎng)箱或水浴孵育20分鐘
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù) 

五、計(jì)算樣品濃度

• 酶標(biāo)儀測定

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對照和樣品
• 分別加入xx微升緩沖液（Reagent B）
• 分別加入xx微升陰性液（Reagent E）或待測樣品（100微克蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）
• 分別加入xx微升底物液（Reagent C）
• 分別加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 放進(jìn)37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育20分鐘
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測
• 濃度計(jì)算：

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對照
• 如果檢測紅細(xì)胞中的SAH濃度，建議使用細(xì)胞S腺苷同型半胱氨酸（SAH或AdoHcy）酶連續(xù)循環(huán)比色法定量檢測試劑盒
• 使用1厘米光徑的比色皿
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品中避免使用DTT、巰基乙醇、TCEP、EDTA等
• 建議使用血漿樣品為佳
• 樣品須澄清，至關(guān)重要
• 測定值由低到高變化
• 比色測定后，比色皿須清洗*
• 建議待測樣本蛋白濃度為100微克/20微升
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 參考值：人體血漿SAM約155納摩爾/升；SAH約20納摩爾/升；SAM/SAH比值約為8.5
• 本公司提供系列醫(yī)學(xué)生化檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感