HL10277.1 v.A

細(xì)胞骨架（肌動蛋白微絲；F-ACTIN）綠色熒光染色試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

細(xì)胞骨架（肌動蛋白微絲；F-ACTIN）綠色熒光染色試劑是一種旨在使用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽（phalloidin），探尋細(xì)胞骨架的絲狀肌動蛋白的分布和局部定向變化狀況的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。主要適用于各種活體細(xì)胞（動物、人體、植物等）的細(xì)胞骨架裝配的檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，反應(yīng)敏感，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

肌動蛋白（actin）是42KD的球蛋白，構(gòu)成細(xì)胞骨架的微絲（microfilament）和肌肉收縮裝置的細(xì)肌絲（thin filament），以及細(xì)胞膜表面?zhèn)巫悖?/span>pseudopodia）和微絨毛（microvilli）。肌動蛋白存在于所有真核生物細(xì)胞中，且高度進(jìn)化保留，參與各種重要細(xì)胞功能，包括細(xì)胞遷移、細(xì)胞分裂、肌肉收縮、細(xì)胞形態(tài)維護(hù)、膜轉(zhuǎn)運（membrane trafficking） 等。哺乳動物具有六種異構(gòu)體，分成α、β、γ三類。球狀肌動蛋白（G-actin）在生理條件下，組合成長絲聚合體，轉(zhuǎn)化為絲狀肌動蛋白（F-actin），形成細(xì)胞骨架的微絲。肌動蛋白的聚合與解聚的動態(tài)學(xué)變化是細(xì)胞骨架裝配（cytoskeleton assembly）的主要參數(shù)之一。鬼筆環(huán)肽（phalloidin）是一種由毒性菇類中分離的二環(huán)七肽（bicyclic heptapeptide）生物堿，與聚合的微絲（F-肌動蛋白）結(jié)合，因此通過異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽可以體外探測細(xì)胞F-肌動蛋白的分布和含量，據(jù)此分析細(xì)胞骨架裝配的調(diào)控機(jī)制。

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）        毫升

固著液（Reagent B）        毫升

通透液（Reagent C）        毫升

封阻液（Reagent D）        毫升

染色液（Reagent E）      微升

復(fù)染液（Reagent F）       微升

產(chǎn)品說明書   1份

保存方式

保存染色液（Reagent E）和復(fù)染液（Reagent F）在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；其余的保存在4℃冰箱里，避免光照；有效保證6月

用戶自備

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于細(xì)胞脫離

*細(xì)胞培養(yǎng)液（12052）：用于中和胰蛋白酶的處理

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于細(xì)胞染色的容器

（微型）臺式離心機(jī)：用于樣品操作

熒光（共聚焦）顯微鏡：用于細(xì)胞熒光觀察

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑置于室溫下凍融。移取xx微升通透液（Reagent C）到1.5毫升離心管，然后分別加入xx微升染色液（Reagent E）和復(fù)染液（Reagent F），混勻后，標(biāo)記為染色工作液，置于冰槽里，放進(jìn)暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作。

• 直接法

• 準(zhǔn)備1個細(xì)胞培養(yǎng)6孔板，內(nèi)置1個細(xì)胞1 X 1 cm大小的載玻片
• 接種待測細(xì)胞培養(yǎng)，直至每孔鋪滿率達(dá)70％ 
• 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液
• 輕輕加上xx微升清理液（Reagent A）到細(xì)胞載玻片上，覆蓋樣品表面
• 小心抽去清理液（Reagent A）
• 輕輕加上xx微升固著液（Reagent B）到細(xì)胞載玻片上，覆蓋樣品表面
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 小心抽去固著液（Reagent B）
• 輕輕加上xx微升通透液（Reagent C）到細(xì)胞載玻片上，覆蓋樣品表面
• 小心抽去通透液（Reagent C）
• 輕輕加上xx微升封阻液（Reagent D）到細(xì)胞載玻片上，覆蓋樣品表面
• 室溫下孵育30分鐘
• 小心抽去封阻液（Reagent D）
• 輕輕加上xx微升清理液（Reagent A）到細(xì)胞載玻片上，覆蓋樣品表面
• 小心抽去清理液（Reagent A）
• 重復(fù)實驗步驟14和15一次
• 小心加上xx微升染色工作液， 覆蓋樣品表面
• 在暗室里室溫下孵育60分鐘
• 小心抽去染色工作液
• 輕輕加上xx微升清理液（Reagent A）到細(xì)胞載玻片上，覆蓋樣品表面
• 小心抽去清理液（Reagent A）
• 封片
• 即刻在熒光（共聚焦）顯微鏡下進(jìn)行觀察（每個視野計數(shù)200個細(xì)胞）：激發(fā)波長488nm，散發(fā)波長530nm（F－肌動蛋白染色）或激發(fā)波長350nm，散發(fā)波長460nm（細(xì)胞核染色）――

綠色熒光顯示F-肌動蛋白；藍(lán)色熒光顯示細(xì)胞核為圓環(huán)或橢圓狀

• 間接法

• 準(zhǔn)備1個25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶的待測細(xì)胞，直至鋪滿率達(dá)70％（約100萬細(xì)胞數(shù)）
• 小心移出細(xì)胞培養(yǎng)液到15毫升錐形離心管（收集懸浮細(xì)胞）
• 加入xx毫升清理液（Reagent A），覆蓋細(xì)胞表面
• 小心移出xx毫升清理液（Reagent A）到15毫升錐形離心管 
• 加入1毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿細(xì)胞表面
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱孵育1分種
• 輕輕手擊震動培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落
• 加入3毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液
• 移入到15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞可以由此步開始）
• 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升清理液（Reagent A），混勻
• 轉(zhuǎn)入到1.5毫升離心管
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升固著液（Reagent B），混勻
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升通透液（Reagent C），混勻
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升封阻液（Reagent D），混勻
• 室溫下孵育30分鐘
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升清理液（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升染色工作液
• 用200微升槍頭上下輕柔抽吸，混勻細(xì)胞顆粒群
• 在暗室里室溫下孵育60分鐘 
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升清理液（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入200微升清理液（Reagent A），混勻
• 即刻移取10微升在載玻片上壓片
• 在熒光（共聚焦）顯微鏡下進(jìn)行觀察（每個視野計數(shù)200個細(xì)胞）：激發(fā)波長488nm，散發(fā)波長530nm（F-肌動蛋白染色）或激發(fā)波長350nm，散發(fā)波長460nm（細(xì)胞核染色）――

綠色熒光顯示F-肌動蛋白；藍(lán)色熒光顯示細(xì)胞核為圓環(huán)或橢圓狀射

注意事項

• 本產(chǎn)品為10次操作
• 在整個操作過程中須戴手套，以防污染
• 孵育時，必須避免光照
• 建議檢測細(xì)胞量達(dá)10⁶細(xì)胞數(shù)為佳
• 用戶可以根據(jù)情況，適度調(diào)整試劑用量
• 建議細(xì)胞染色完成后，即刻進(jìn)行熒光分析，不宜超過1小時 
• 注意：紫杉醇（PACLITAXEL），使F-肌動蛋白含量增加，熒光增強(qiáng)
• 本公司提供系列細(xì)胞骨架檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰