HL50300.1 v.A

細(xì)胞乙醛脫氫酶2活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

細(xì)胞乙醛脫氫酶2活性比色法定量檢測(cè)試劑盒是一種旨在使用乙醛脫氫酶2敏感性抑制劑，通過檢測(cè)反應(yīng)系統(tǒng)中氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）還原后峰值的增高，即采用比色法來測(cè)定細(xì)胞裂解萃取液樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等裂解懸液樣品（動(dòng)物、人體等）乙醛脫氫酶2的特異活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase；ALDH；EC1.2.1.3），又稱為乙醛NAD氧化還原酶（aldehyde NAD－oxidoreductase）是一類NAD（P）依賴性酶，催化廣譜的外源性或內(nèi)源性脂肪族和芳香族乙醛類底物氧化，包括乙醇、氨基酸、生物胺（biogenic amine）、維生素、固醇類、脂質(zhì)、藥物和環(huán)境分子等代謝產(chǎn)物。乙醛脫氫酶是乙醇在體內(nèi)分解代謝過程中兩種主要酶之一。乙醛脫氫酶把乙醛中的兩個(gè)氫原子脫掉，使乙醛轉(zhuǎn)化為乙酸，生成的乙酸進(jìn)入脂肪酸氧化途徑，zui終被氧化成二氧化碳和水。乙醛脫氫酶主要有兩種同工酶：ALDH₁和ALDH₂。ALDH₁存在于胞液中，ALDH₂存在于線粒體中，ALDH₂比ALDH₁的活性高。乙醛脫氫酶的缺少，使酒精不能被*分解為水和二氧化碳，而是以乙醛繼續(xù)留在體內(nèi)，使人喝酒后產(chǎn)生干惡反胃欲吐、昏迷不適等醉酒癥狀。基于來自于乙醇代謝產(chǎn)生的乙醛（acetaldehyde），在7-羥基-3-（4-羥苯基）-異黃酮-7-糖苷（Daidzein-7-O-β-D-glucopyranoside；Daidzin）存在與否的情況下，由乙醛脫氫酶2的催化作用，轉(zhuǎn)化為乙酸（acetic acid）產(chǎn)物后，通過測(cè)定反應(yīng)體系中氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（oxidized reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）轉(zhuǎn)化為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）的變化（340nm 波長(zhǎng)），來定量分析乙醛脫氫酶2的特異活性。乙醛脫氫酶2反應(yīng)系統(tǒng)為：

ALDH

CH₃OH  +  NAD⁺  +  H₂O  →  CH₃COOH  +  NADH  +  H⁺

 Daidzin

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A） 毫升

裂解液（Reagent B） 毫升

緩沖液（Reagent C） 毫升

反應(yīng)液（Reagent D） 毫升

底物液（Reagent E）   毫升

陰性液（Reagent F）   毫升

專性液（Reagent G）   微升

產(chǎn)品說明書 1份

保存方式

保存緩沖液（Reagent C）、反應(yīng)液（Reagent D）、底物液（Reagent E）和專性液（Reagent G）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；反應(yīng)液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于脫離貼壁細(xì)胞

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備

比色皿或酶標(biāo)板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的裂解液（Reagent B）置入冰槽里預(yù)冷。然后進(jìn)行下列操作。

• 樣品準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁶細(xì)胞）
• 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面
• 小心抽去清理液
• 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

• 測(cè)定準(zhǔn)備

• 開啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長(zhǎng)340nm，間隔60秒，讀數(shù)5次（共5分鐘），并置零 
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；底物液（Reagent E）避免光照；緩沖液（Reagent C）置于室溫下均衡溫度

• 背景對(duì)照測(cè)定

• 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入xx微升底物液（Reagent E）
• 在25℃溫度下孵育3分鐘
• 加入xx微升陰性液（Reagent F）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照（5分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

• 樣品總活性測(cè)定

• 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入xx微升底物液（Reagent E）
• 在25℃溫度下孵育3分鐘
• 加入20微升待測(cè)樣品（或50微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)（5分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)） 

• 樣品非特異活性測(cè)定

• 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升專性液（Reagent G）
• 加入20微升待測(cè)樣品（或50微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在25℃溫度下孵育10分鐘
• 加入xx微升緩沖液（Reagent C）
• 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入xx微升底物液（Reagent E）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)（5分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)） 

六、計(jì)算樣品活性

1）樣品活性（總活性或非特異活性）

【（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 1（體系容量，毫升）X樣品稀釋倍數(shù)】÷【0.02（樣品容量，毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù) X 5（反應(yīng)時(shí)間，分鐘）】＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾NAD/分鐘

2）樣品特異活性

樣品總活性測(cè)定－樣品非特異活性測(cè)定＝樣品特異活性

• 酶標(biāo)板測(cè)定

• 背景對(duì)照和樣品總活性

• 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照、樣品總活性
• 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到96孔板中
• 分別加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）
• 分別加入xx微升底物液（Reagent E）
• 在25℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入xx微升陰性液（Reagent F）或待測(cè)樣品（或10微克蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)

2. 樣品非特異活性

• 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：樣品非特異活性
• 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到96孔板中
• 加入xx微升專性液（Reagent G）
• 加入5微升待測(cè)樣品（或10微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板
• 在25℃溫度下孵育10分鐘
• 加入xx微升緩沖液（Reagent C）
• 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入xx微升底物液（Reagent E）
• 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)

3. 計(jì)算樣品活性

1）樣品活性（總活性或非特異活性）

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.25（毫升，測(cè)定容量）]÷[0.005（樣品容量，毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X 0.6（厘米）X 5（分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克 

單位＝微摩爾NAD/分鐘

2）樣品特異活性

樣品總活性測(cè)定－樣品非特異活性測(cè)定＝樣品特異活性

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次（比色皿；10個(gè)樣本）和80次（酶標(biāo)板；40個(gè)樣本）操作，包括背景對(duì)照
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測(cè)定只需1次
• 建議使用比色皿測(cè)定
• 樣品須澄清，至關(guān)重要 
• 加樣后3秒內(nèi)比色測(cè)定
• 測(cè)定值由低到高變化；測(cè)定可持續(xù)5分鐘
• 比色測(cè)定后，比色皿須清洗*
• 樣本測(cè)定5分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為50微克/20微升 （本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 如果待測(cè)樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 乙醛脫氫酶2單位活性定義為：在25℃，pH 8.0條件下，每分鐘內(nèi)能夠轉(zhuǎn)化1微摩爾氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列乙醇代謝酶類檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感