主要用途

細(xì)菌糖類總量硫酸-比色法定量檢測試劑是一種旨在通過硫酸處理后，水解產(chǎn)生單糖，與反應(yīng)，生成黃色產(chǎn)物，即采用比色法測算糖類總量的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種細(xì)菌細(xì)胞樣品中糖類總量的檢測。產(chǎn)品即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，檢測敏感。

技術(shù)背景

糖類（saccharide），又稱為碳水化合物（carbohydrate），其分成四類：單糖（monosaccharide；例如葡萄糖）、二糖（disaccharide；例如蔗糖）、寡糖（oligosaccharide；棉籽糖）和多糖（polysaccharide；例如淀粉和糖原）。糖類構(gòu)成輔酶和核酸，以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重要元素，在能量儲存、免疫功能、授精、預(yù)防病理變化、血液凝結(jié)、發(fā)育等方面具有重要作用。使用濃硫酸，將復(fù)雜性多糖水解成單糖，脫水產(chǎn)生反應(yīng)性中間產(chǎn)物，與反應(yīng)，生成黃色產(chǎn)物，在分光光度儀（492nm 波長）下出現(xiàn)吸光峰值的變化，來定量測定樣品中糖類量的總含量。 

產(chǎn)品內(nèi)容

稀釋液（Reagent A）          5毫升

反應(yīng)液（Reagent B）         5毫升

酸性液（Reagent C）         25毫升

標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）         500微升

裂解液（Reagent E）         10毫升

產(chǎn)品說明書               1份

保存方式

保存在4℃冰箱里；酸性液（Reagent C）具有腐蝕性，注意操作安全；反應(yīng)液（Reagent B）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于標(biāo)準(zhǔn)樣品配制和反應(yīng)的容器

干式恒溫儀或恒溫水槽：用于反應(yīng)孵育

超聲儀：用于裂解細(xì)菌細(xì)胞

比色皿：用于比色的容器

分光光度儀：用于比色分析 

實驗步驟

一、樣品準(zhǔn)備 

1．準(zhǔn)備好10毫升待測的細(xì)菌放進(jìn)37℃搖床孵育16小時，速度為220RPM

2．直至OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 107細(xì)胞/毫升

3．置于冰槽里5分鐘

4．放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g

5．小心抽去上清液

6．加入500微升裂解液（Reagent E），充分混勻

7．轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

8．強(qiáng)力渦旋震蕩15秒

9．置于超聲儀下：200瓦，50%功率，10秒一次，重復(fù)3次

10．冰槽里靜置15分鐘

11．放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

12．小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

13．移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

14．即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、標(biāo)準(zhǔn)樣品配制

1．準(zhǔn)備好5個1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號管

2．分別加入200微升稀釋液（Reagent A）到每個離心管

3．移取200微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到1號管，混勻

4．小心移取200微升1號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到2號管，混勻

5．小心移取200微升2號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到3號管，混勻

6．小心移取200微升3號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到4號管，混勻

7．將1至5號管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表

三、樣品測定

1．設(shè)定好分光光度儀：波長492nm，并置零

2．分別移取200微升反應(yīng)液（Reagent B）到1.5毫升離心管

3．分別加入200微升上述制備的標(biāo)準(zhǔn)樣品或待測樣品，混勻

4．分別加入1毫升酸性液（Reagent C），混勻

5．在80℃干式恒溫儀孵育30分鐘（注意：如果復(fù)雜多糖無法充分水解，建議使用煮沸5至30分鐘處理）

6．室溫下冷卻10分鐘，避免光照

7．轉(zhuǎn)移到新的比色皿

8．即刻放進(jìn)分光光度儀檢測（492nm波長）：獲得吸光讀數(shù)

9．構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光讀數(shù)；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖含量（微克）

10．根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)麥芽糖含量（微克）

11．計算樣品實際麥芽糖濃度（微克/毫升） 

【根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)麥芽糖含量（微克）÷0.2（樣品容量：毫升）】×10（樣品稀釋倍數(shù)）=微克/毫升

注意事項

1．本產(chǎn)品為25次操作，包括標(biāo)準(zhǔn)液

2．本產(chǎn)品適用于還原性、非還原性糖類、寡糖以及復(fù)雜性糖類，但不適合于氨基糖或脫氧糖及其衍生物

3．本產(chǎn)品檢測范圍為0.2至50微克糖類總量

4．本產(chǎn)品適用于96孔板操作，實際用量按比例減少

5．操作時，須戴手套

6．酸性液（Reagent C）具有腐蝕性，注意操作安全

7．孵育時，避免光照

8．如果待測樣品濃度過高或過低，可以稀釋樣品用量；注意在計算實際濃度時，不要忘記稀釋倍數(shù)調(diào)整

9．糖類總量表述方式：微克麥芽糖/毫升；微克麥芽糖/細(xì)胞量；微克麥芽糖/總蛋白量

10．本公司提供系列糖類檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1.本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2.本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感