細胞CDK1/CYCLIN B激酶活性光度法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

細胞CDK1/CYCLIN B激酶活性光度法定量檢測試劑是一種旨在通過多肽底物，受到CDK1/CYCLIN B磷酸化后，進而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應系統(tǒng)，測定產(chǎn)生ADP過程中，伴隨的還原型腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應， 即采用光度法測定其氧化后峰值的變化，以分析細胞裂解樣品中CDK1/CYCLIN B特異活性的而經(jīng)典的技術方法。該技術經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃取液樣品（動物、人體）、部分或純化酶樣品中CDK1/CYCLIN B激酶的特異活性定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。

技術背景

細胞周期素依賴性激酶1（cyclin dependent kinase 1；CDK1），又稱為細胞分裂周期蛋白2（cell division cycle2；CDC2）或p34^cdk1，屬于激酶（serine/threonine protein kinase）家屬成員之一。其為高度進化保留的激酶復合物，成熟促進因子（maturation promoting factor；MRF）中的催化亞體，含有297氨基酸，與細胞周期素B結(jié)合，允許細胞由G2期進入有絲分裂期以及由G1期進入DNA合成期，達到調(diào)節(jié)細胞生長、DNA復制、細胞分裂等。其磷酸化目標序列為 GGGRSPGRRRRK。基于底物GGGRSPGRRRRK，在ATP的存在下，受到CDK1/CYCLIN B激酶的磷酸化，獲得產(chǎn)物磷酸化多肽，進而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應系統(tǒng)中，還原型腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的變化（340nm），來定量分析細胞周期素依賴性激酶1/細胞周期素B的特異活性。其反應方式為：

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）         毫升

裂解液（Reagent B）         毫升

緩沖液（Reagent C）          毫升

酶促液（Reagent D）          微升

反應液（Reagent E）          微升

底物液（Reagent F）         微升

陰性液（Reagent G）          微升

產(chǎn)品說明書               1份

保存方式

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴格避免光照和反復凍融；有效保證6月

用戶自備

CDK1/CYCLIN B激酶：用于抑制劑篩選

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

細胞刮脫棒：用于貼壁細胞脫離

（微型）臺式離心機：用于細胞預處理

100微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器

分光光度儀或酶標儀：用于樣品光度分析

實驗步驟

一、 待測樣品準備

1． 準備好25cm²細胞培養(yǎng)瓶或60mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞（1至5 X 10⁶細胞）

2． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：避免使用消化）

5． 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細胞

6． 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）

7． 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混勻

10． 轉(zhuǎn)移到預冷的1.5毫升離心管

11． 強力渦旋震蕩15秒

12． 置于冰槽里孵育30分鐘

13． 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管

15． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

16． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測定準備

1． 準備好待測樣品（例如細胞裂解懸液等），置于冰槽里 

2． 設定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為340nm，間隔1分鐘，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零

三、 背景對照測定

1． 移取65微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入10微升酶促液（Reagent D）

3． 加入10微升反應液（Reagent E）

4． 加入10微升底物液（Reagent F）

5． 放進30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6． 加入5微升陰性液（Reagent G）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)5分鐘

四、 樣品測定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升酶促液（Reagent D）

3． 加入xx微升反應液（Reagent E）

4． 加入xx微升底物液（Reagent F）

5． 放進30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6． 加入5微升待測樣品（注意：50微克細胞裂解蛋白；樣品須溶解）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)5分鐘