1  范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品用雙歧桿菌（Bifidobacterium）的鑒定及計(jì)數(shù)方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品用雙歧桿菌純菌菌種的鑒定及計(jì)數(shù)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中僅含有單一的雙歧桿菌菌種的鑒定；以及食品中僅含有雙歧桿菌屬的計(jì)數(shù)，雙歧桿菌屬可包含一種或多種不同的雙歧桿菌菌種。

2  設(shè)備和材料

除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：

2.1  恒溫培養(yǎng)箱：36 ℃±1 ℃。

2.2  冰箱：2 ℃～5 ℃。

2.3  天平：感量0.1 g。

2.4  無菌試管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。

2.5  無菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及配套吸頭。

2.6  無菌培養(yǎng)皿：直徑90 mm。

3  培養(yǎng)基和試劑

3.1  雙歧桿菌培養(yǎng)基：見附錄A.1。

3.2  PYG培養(yǎng)基：見附錄A.2。

3.3  甲醇：分析純。

3.4  三氯甲烷：分析純。

3.5  冰乙酸：分析純。

3.6  乳酸：分析純。

3.7  乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：吸取分析乙酸5.7 mL，移入100 mL容量瓶中，加水至刻度，標(biāo)定方法見附錄B.1，此溶液濃度約為1 mol/L。

3.8  乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：吸取分析純?nèi)樗?.4 mL，移入100 mL容量瓶中，加水至刻度，標(biāo)定方法見附錄B.1，此溶液濃度約為1 mol/L。

4  檢驗(yàn)程序

雙歧桿菌的檢驗(yàn)程序見圖1。

圖1  雙歧桿菌的檢驗(yàn)程序

5  操作步驟

5.1  無菌要求：全部操作均應(yīng)遵循無菌操作程序。

5.2  食品用雙歧桿菌純菌菌種的鑒定及計(jì)數(shù)

5.2.1  鑒定

5.2.1.1  接種：半固體或液體菌種直接接種在雙歧桿菌瓊脂平板。真空冷凍干燥菌種，先加適量滅菌生理鹽水，溶解菌粉，然后接種在雙歧桿菌瓊脂平板。平板在36 ℃±1 ℃厭氧培養(yǎng)48 h±2 h。

5.2.1.2  涂片鏡檢：雙歧桿菌為革蘭氏染色陽性，不抗酸、無芽孢、無動(dòng)力，菌體形態(tài)多樣，呈短桿狀、纖細(xì)桿狀或球形，可形成各種分支或分叉形態(tài)。

5.2.1.3  生化鑒定：挑取5.2.1.1步驟中的平板上生長的單個(gè)菌落，進(jìn)行生化反應(yīng)檢測(cè)。雙歧桿菌的過氧化氫酶試驗(yàn)為陰性。不同雙歧桿菌菌種的主要生化反應(yīng)見表1。

5.2.1.4  氣相色譜法測(cè)定雙歧桿菌的有機(jī)酸代謝產(chǎn)物（可選項(xiàng)），見附錄B.1。

5.2.2  計(jì)數(shù)

5.2.2.1  樣品的稀釋

5.2.2.2.1  取1.0 g固體菌種溶解于9.0 mL生理鹽水或其它稀釋液，制成1:10的樣品勻液。

5.2.2.2.2  用1 mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1.0 mL，沿管壁緩慢注于裝有9.0 mL稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭不要觸及稀釋液），振搖試管或換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。

5.2.2.2.3  另取1 mL無菌吸管或吸頭，按5.2.2.2.1操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，即換用1次1 mL滅菌吸管或吸頭。

5.2.2.2.4  根據(jù)對(duì)樣品雙歧桿菌濃度的估計(jì)，選擇2個(gè)～3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，在進(jìn)行10倍遞增稀釋時(shí)，吸取1.0 mL樣品勻液于無菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。同時(shí)，分別吸取1.0 mL空白稀釋液加入兩個(gè)無菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。

5.2.2.2.5  及時(shí)將 15 mL～20 mL冷卻至 46 ℃的雙歧桿菌瓊脂培養(yǎng)基（可放置于46 ℃±1 ℃恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。

5.2.2.2  培養(yǎng)

待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36 ℃±1 ℃厭氧培養(yǎng)48 h±2 h。

5.2.2.3  菌落計(jì)數(shù)

可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落

形成單位（colony-forming units，CFU）表示。

5.2.2.3.1  選取菌落數(shù)在30 CFU～300 CFU 之間、無蔓延菌落生長的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30 CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300 CFU的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。

5.2.2.3.2  其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2，代表一個(gè)平板菌落數(shù)。

5.2.2.3.3  當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長時(shí)，則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。

5.3  食品中雙歧桿菌的鑒定及計(jì)數(shù)

5.3.1  鑒定

5.3.1.1  稱重取樣25.0 g，或體積取樣25.0 mL，置于裝有225 mL稀釋液的滅菌錐形瓶內(nèi)，制成1:10的樣品勻液。

5.3.1.2  將上述樣品勻液接種在雙歧桿菌瓊脂平板。平板在36 ℃±1 ℃厭氧培養(yǎng)48 h±2 h。

5.3.1.3  純培養(yǎng)

挑取3個(gè)或以上的單個(gè)菌落接種于雙歧桿菌瓊脂平板。平板在36 ℃±1 ℃厭氧培養(yǎng)48 h±2 h。

5.3.1.4  涂片鏡檢：參照5.2.1.2。

5.3.1.5  生化鑒定：參照5.2.1.3。

5.3.1.6  氣相色譜法測(cè)定雙歧桿菌的有機(jī)酸代謝產(chǎn)物，參照5.2.1.4。

5.3.2  計(jì)數(shù)

5.3.2.1  同5.3.1.1步。

5.3.2.2  稀釋步驟  參照5.2.2.1。

5.3.2.3  菌落計(jì)數(shù)  參照5.2.2.3。

6  報(bào)告

6.1  鑒定

根據(jù)5.2.1.2項(xiàng)鏡檢、5.2.1.3項(xiàng)生化鑒定，報(bào)告雙歧桿菌屬的種名。根據(jù)5.2.1.4項(xiàng)乙酸與乳酸微摩爾之比，報(bào)告雙歧桿菌的有機(jī)酸代謝產(chǎn)物。

6.2  計(jì)數(shù)

6.2.1  菌落計(jì)數(shù)的計(jì)算方法和報(bào)告：參照GB 4789.2《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》中的7.1和7.2。

6.2.2  稱重取樣以CFU/g為單位報(bào)告，體積取樣以CFU/mL為單位報(bào)告。