細胞支原體污染的熒光檢測方法

配制試劑：

1.無菌HBSS：配制Hanks’ balanced salt solution，以0.22mm無菌過濾膜過濾滅菌。勿用高壓蒸汽滅菌。 

2.Hoechst 33258 stock solution（100X）：稱取5.0 mg bisbenzimide和10.0 mg thimersol溶于100 ml無菌HBSS，置于棕色瓶中，室溫下以電磁攪拌器攪拌30分鐘至*溶解后，以1ml分裝至1.5ml小離心管中，貯存于-20℃。 

3.Hoechst 33258 working reagent：取1 ml Hoechst 33258 stock solution，加入sterile 100 ml HBSS中，室溫下攪拌45分鐘，置于棕色瓶中并以鋁箔紙包覆，避免光照，貯存于4℃。 

4.mounting solution：22.2 ml 0.1 M citric acid和27.8 ml 0.2 M Na2HPO4加入于50 ml glycerol中混合，以1 N NaOH調整pH至5.5（pH很重要），貯存于4℃。 

5.固定溶液（fixative）：冰醋酸與甲醇以1：3之體積比例混合，使用前才配制。 

步驟： 

1.培養(yǎng)Vero細胞： Vero細胞可作長期培養(yǎng)或制作多個冷凍保存管，測試前解凍培養(yǎng)。測試前一周培養(yǎng)Vero細胞。 

2.在接種測試樣品前一日，以trypsin-EDTA溶液處理Vero細胞，制成細胞懸浮液，以1~2x10^4 cells／ml培養(yǎng)于chamber slide中，每個well加入1ml細胞懸浮液，于37℃, 5％CO2培養(yǎng)。隔日確定生長良好后，即可接種測試樣品。 

3.接種測試樣品：樣品種類：1ml待測之培養(yǎng)基，1ml待測細胞培養(yǎng) 液（可將細胞稍微刮下：，0.05~0.1ml冷凍管之細胞懸浮液。 

4.將測試樣品加入chamber slide內，培養(yǎng)5天后，進行Hoechst 33258的熒光染色觀察。 

5.以Acholeplasma laidlawii ATCC 23206 感染Vero細胞作為正反應對照組：或是已感染支原體之細胞培養(yǎng) 液或冷凍細胞液：，負反應對照組為Vero cell之新鮮培養(yǎng)基（ αMEM +10%FBS）。 

6.DNA熒光染色檢測： 
①取出培養(yǎng)5日之Vero細胞，吸除培養(yǎng)液。于每個well中加入2ml 1：3混合的冰醋酸/甲醇固定液，靜置10 min后，吸除固定液。重復上述之步驟，風干10分鐘。②于每個well中，加入1ml Hoechst 33258 working solution，室溫下靜置30min。③吸掉Hoechst 33258染液后，以無菌水洗滌3次，風干后加入1滴的mounting solution，并以蓋玻片覆蓋之。④以100x-400x熒光顯微鏡觀察。打開水銀光源10 min后，以UV激發(fā)光束（330～380 nm）之濾光鏡，觀察細胞核外是否有藍色熒光小點或是絲狀點之熒光物產生。 

細胞支原體污染的熒光檢測方法

結果判讀：

若有支原體污染，在Vero細胞核外與細胞表面會出現(xiàn)藍色熒光小點或是絲狀點。其形狀一致，與細胞殘片染成之不規(guī)則點狀物不同。其熒光可維持數(shù)星期。
圖例 （A）為negative result ： 熒光顯微鏡下，只觀察到Vero細胞的細胞核，測試樣品沒有支原體的污染。（為positive result ： 在Vero細胞核外與細胞表面會出現(xiàn)藍色熒光小點和絲狀點，表示測試樣品有支原體的污染。 

（A）Negative result 
熒光顯微鏡下，只觀察到Vero細胞的細胞核，測試樣品沒有支原體的污染。