*a1抗體的制備及其效價(jià)測(cè)定

【摘要】  目的 制備用于檢測(cè)*α1基因工程表達(dá)產(chǎn)物的特異性抗體。方法 以提純的*α1與牛血清白蛋白偶聯(lián)后作為抗原,皮下多點(diǎn)注射免疫大鼠。經(jīng)過(guò)3個(gè)月的免疫,獲得抗*α1的多克隆抗體。結(jié)果 用間接酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）方法,測(cè)定抗體效價(jià)超過(guò)5,000,顯示該抗體能與*α1抗原特異性地產(chǎn)生明顯免疫反應(yīng)。結(jié)論 采用本法制備的抗體具有很好的靈敏性和特異性。為*α1的分離純化及大規(guī)模生產(chǎn)，從而為進(jìn)一步滿足臨床需要奠定了基礎(chǔ)。 

【關(guān)鍵詞】  *α1抗體　酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)

　　*（Thymosin α1，Tα1）作為一種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑（BRM）〔1～4〕,在臨床中具有良好療效，主要治療乙型肝炎〔5，6〕、丙型肝炎〔7〕及多種惡性腫瘤〔8，9〕，也用于艾滋病等免疫缺陷性疾病的治療。制備Tα1特異性的抗體對(duì)于Tα1基因的表達(dá)產(chǎn)物的鑒定至關(guān)重要。本文用大鼠作為免疫動(dòng)物,采用皮下多點(diǎn)免疫注射的方法，獲得了滿意的抗Tα1抗體。

*a1抗體的制備及其效價(jià)測(cè)定

　1 　 材料與方法

　　11 　材料與試劑                         

　　Tα1購(gòu)自市售成都地奧九泓制藥廠,規(guī)格16 mg/瓶;牛血清白蛋白、*福氏佐劑及不*福氏佐劑、辣根酶標(biāo)記山羊抗大鼠Ig G（H+L）均購(gòu)自北京鼎國(guó)生物公司;大鼠,雌性，6～8周齡，225～234 g，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供。

　　12 　 方法

　　121 　制備偶聯(lián)復(fù)合體                         

　　用pH 74的01 mol/L PBS 緩沖液溶解Tα1和BSA,緩慢加入60%戊二醛、05 mol/L NaCl,使Tα1的終濃度為01 mg/ml,置于振蕩器中輕微振蕩3 h。

　　122 　 制備抗體血清

　　1221 　卡介苗致敏                         

　　在動(dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)飼養(yǎng)大鼠6只,觀察2 w，其健康狀態(tài)良好后,每只大鼠后足掌皮下注射005 ml卡介苗。

　　1222  　第1次免疫注射                         

　　卡介苗致敏2 w后,以BSATα1偶聯(lián)產(chǎn)物做抗原,與等體積*福氏佐劑充分乳化后,免疫注射。位點(diǎn)在大腿肌肉腹股溝處,每點(diǎn)皮下注射02 ml，陰性對(duì)照注射等量生理鹽水。

　　1223 　第2次免疫注射                         

　　*次免疫注射2 w后,選擇脊椎兩旁各4個(gè)位點(diǎn),腹股溝各1點(diǎn),每點(diǎn)02 ml進(jìn)行皮下免疫注射。

　　1224 　第3次免疫注射                        

　　 2 w后,免疫注射位點(diǎn)在背部脊柱旁各3個(gè),腹股溝及腋下各1點(diǎn),每點(diǎn)02 ml。

　　1225 　加強(qiáng)免疫                         

　　第3次免疫注射后,每隔20～25 d,以不*福氏佐劑與Tα1BSA偶聯(lián)復(fù)合物經(jīng)充分乳化后進(jìn)行背部多點(diǎn)免疫;zui后1次免疫后的第7天采血,4℃冰箱過(guò)夜,離心分離血清。用ELISA法測(cè)定其效價(jià),達(dá)到要求后,眼球取血,獲得血清,分裝保存在-20℃冰箱備用。

　　123　抗血清的純化                         

　　用硫酸銨鹽沉淀提純抗體〔10～12〕。

　　1231　鹽析                        

　　 取分離后獲得的血清與等量生理鹽水混合稀釋,于攪拌下逐滴加入等量的飽和硫酸銨,使其終濃度為50%,4℃冰箱過(guò)夜,使其充分沉淀。經(jīng)離心后棄去上清，以生理鹽水溶解沉淀。再逐滴加入飽和硫酸銨，使其終濃度為33%，4℃冰箱過(guò)夜。重復(fù)用50%及33%的飽和硫酸銨依次提取。將末次離心后所得沉淀物以002 mol/L PBS溶解后裝入透析袋。

　　1232 　除鹽                        

　　 將盛裝鹽析物溶液的透析袋置于大燒杯中，在電磁攪拌下，以蒸餾水和生理鹽水交替透析48 h,此過(guò)程每隔3～4 h換液。

　　124 　ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)

　　1241 　 包被                         

　　用pH 96碳酸鹽緩沖液稀釋Tα1至終濃度5 μg/ml,包被酶標(biāo)板，將酶標(biāo)板放入濕盒中，置4℃冰箱過(guò)夜。

　　1242  　封閉                         

　　封閉液用pH 74 PBSTween 20，加5%脫脂奶粉。

　　1243  　加一抗                         

　　以pH 74 PBSTween 20奶粉為稀釋液,將免疫后的大鼠陽(yáng)性血清作不同梯度稀釋;陰性對(duì)照用未免疫的大鼠陰性血清。

　　1244  　加酶標(biāo)二抗                         

　　用pH 74 PBSTween 20脫脂奶粉按1∶1 000稀釋酶標(biāo)二抗山羊抗大鼠HRP。

　　1245 　加底物                         

　　加入TMB顯色液,37℃避光顯色15～20 min后,加入2 mol/L H2SO4 終止反應(yīng)。

　　1246 　讀數(shù)                         

　　用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)下讀取吸光值。每次操作間采用浸泡式洗滌方法充分洗滌3次，以除去多余的游離反應(yīng)物。

　　13 　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理                       

　　采用SPSS115軟件包處理數(shù)據(jù)。

　　2　結(jié)果

　　21　抗體的制備                         

　　本次實(shí)驗(yàn)所用大鼠在三個(gè)月的免疫過(guò)程中狀態(tài)良好，無(wú)一例死亡，其免疫前后體重變化無(wú)明顯差異（P＞005）見(jiàn)表1。免疫結(jié)束，每只大鼠眼球取血獲得5～6 ml的免疫血清。表1 免疫前后大鼠體重變化（略）

　　22 　抗體的ELISA檢測(cè)                         

　　以未免疫的大鼠血清作為對(duì)照，用制備的抗體作為一抗進(jìn)行ELISA檢測(cè),均有陽(yáng)性反應(yīng)，均為P/N＞21（P:陽(yáng)性血清OD490；N：陰性血清OD490）,測(cè)得OD值，見(jiàn)表2。表2  ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)（略）

　3 勝*提純抗體與未提純抗體的比較                          

*a1抗體的制備及其效價(jià)測(cè)定

　2

　　經(jīng)采用相同針劑、相同條件以提純和未提純的抗體作ELISA檢測(cè),發(fā)現(xiàn)提純的抗體其陽(yáng)性反應(yīng)明顯比未提純的抗體強(qiáng)。1∶10時(shí)，提純抗體與未提純抗體兩組比較P＜001；1∶100、1∶1 000、1∶3 000、1∶5 000時(shí)，兩組比較P＜005。證明提純抗體特異性,靈敏度均比未提純的效果好，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。表3　 提純抗體與未提純抗體的比較（略）

　　Tα1為免疫原性差的小分子量肽，而戊二醛能分別將藥物與載體蛋白的伯氨基以五肽鏈的橋連接起來(lái)〔11〕，Tα1與載體蛋白偶聯(lián)后免疫動(dòng)物,能提高其免疫原性。選擇大鼠做免疫動(dòng)物的優(yōu)點(diǎn)是,大鼠活力強(qiáng),飼養(yǎng)條件要求較低,免疫中途死亡率低，本次實(shí)驗(yàn)所用大鼠在三個(gè)月的免疫過(guò)程中狀態(tài)良好，均未死亡;此外,大鼠個(gè)體適中,所需抗原用量不大,而且其體積比小鼠大,收獲血量相對(duì)多,制備的血清量大。本實(shí)驗(yàn)采用上述方法，從一只大鼠中可以獲得5～6 ml的免疫血清。此外，制定合理的免疫程序也是獲得理想抗體的關(guān)鍵，抗原免疫前使用卡介苗致敏,能夠明顯調(diào)動(dòng)大鼠免疫系統(tǒng),產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng),并對(duì)產(chǎn)生高滴度的抗Tα1抗體有促進(jìn)作用。ELISA是將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的催化作用相結(jié)合的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，具有特異性強(qiáng),靈敏度高的優(yōu)點(diǎn),在適宜條件下,能準(zhǔn)確測(cè)定血清抗體效價(jià)。由于所制備的抗體與BSA偶聯(lián),因此,在包被液和一、二抗抗體稀釋液中不應(yīng)包含BSA,本試驗(yàn)用濃度為5%的脫脂奶粉作封閉,達(dá)到較好的效果。本實(shí)驗(yàn)為檢測(cè)Tα1表達(dá)產(chǎn)物提供了靈敏度高,特異性強(qiáng)的抗體,為Tα1的分離純化及大規(guī)模生產(chǎn)，從而為進(jìn)一步滿足臨床需要奠定了基礎(chǔ)。