制備大量具有活性的原生質(zhì)體是微生物原生質(zhì)體融合育種的前提。活性原生質(zhì)體制備過程包括原生質(zhì)體的分離、收集、純化、活性鑒定和保存等操作步驟。

    為了制備原生質(zhì)體，必須有效地除去細(xì)胞壁。細(xì)胞去壁后，原生質(zhì)體從中分離出來，此過程稱為原生質(zhì)體分離。去壁的方法有三種：機(jī)械法、非酶分離法和酶法。以酶法zui為常用。酶法分離原生質(zhì)體的本質(zhì)是以微生物細(xì)胞壁為底物的酶水解反應(yīng)。

(1)酶法制備原生質(zhì)體的條件

①培養(yǎng)基組成酶法分離原生質(zhì)體，首先要培養(yǎng)菌體。培養(yǎng)菌體時(shí)不同的培養(yǎng)基會(huì)明顯影響原生質(zhì)體的形成。一般放線菌只有在加*的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，才能使酶類易于滲入和瓦解細(xì)胞壁，釋放原生質(zhì)體。加入*的濃度通常控制在明顯抑制菌體生長(zhǎng)但能獲得適量的菌絲體為宜。

②菌體培養(yǎng)方式菌體培養(yǎng)可采用平板玻璃紙法，或振蕩沉沒培養(yǎng)法，也可以把振蕩培養(yǎng)的菌絲體采用勻漿器或超聲波破碎法，使菌絲斷裂或細(xì)胞壁松弛。

③菌體菌齡微生物生理狀態(tài)是決定原生質(zhì)體形成的主要因素之一，尤其是菌齡，明顯影響原生質(zhì)體形成的頻率。絲狀真菌以年輕的菌絲來分離原生質(zhì)體，尤其是菌絲生長(zhǎng)點(diǎn)，其復(fù)制周期與原生質(zhì)體形成有密切關(guān)系。具體的菌齡隨菌種和培養(yǎng)條件而異，細(xì)菌和霉菌一般采用對(duì)數(shù)期，而放線菌以對(duì)數(shù)期到靜止期的轉(zhuǎn)換期較理想。

④穩(wěn)定劑原生質(zhì)體由于剝除了細(xì)胞壁，失去了細(xì)胞壁*的保護(hù)作用，因此對(duì)外界環(huán)境變得十分敏感，尤其是滲透壓。如果把原生質(zhì)體懸浮在蒸餾水或低滲溶液中，則原生質(zhì)體會(huì)膨脹破裂，所以必須在一定濃度的高滲溶液中進(jìn)行酶解、破壁，才能形成和保持穩(wěn)定的原生質(zhì)體。這種高滲溶液被稱為穩(wěn)定劑。穩(wěn)定劑的種類有無機(jī)鹽和有機(jī)物，無機(jī)鹽包括NaCl、KCl、MgSO4、CaCl 2等。有機(jī)物包括蔗糖、甘露糖、*等。

⑤酶解前的預(yù)處理用酶水解細(xì)胞壁，首先要使酶滲透到細(xì)胞壁中去。但生物體都有保護(hù)自身的一套嚴(yán)密的結(jié)構(gòu)，不是任何物質(zhì)都可以隨意進(jìn)入細(xì)胞壁。因此。在酶解前要根據(jù)細(xì)胞壁的不同結(jié)構(gòu)和組成加人某些物質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理，以抑制或阻止某一細(xì)胞壁成分的合成，從而使酶易于滲入細(xì)胞壁，提高酶對(duì)細(xì)胞壁的水解效果。如SH一化合物廣泛應(yīng)用于酵母菌和絲狀真菌的預(yù)處理，效果較好，其作用主要是還原細(xì)胞壁中蛋白質(zhì)的二硫鍵，使分子鏈切開，酶分子容易滲入，促進(jìn)細(xì)胞壁水解，釋放原生質(zhì)體。在腐霉中加入Triton X一100或脂肪酶后，可以除去細(xì)胞壁上的脂肪層，促進(jìn)酶分子進(jìn)入細(xì)胞壁，有利于原生質(zhì)體的釋放。酵母菌常用EDTA或EDTA加巰基乙醇進(jìn)行預(yù)處理。在放線菌培養(yǎng)液中加入*有利于原生質(zhì)體的釋放，其作用是在細(xì)胞壁合成過程中*錯(cuò)誤替代*而干擾細(xì)胞壁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的合成，使酶進(jìn)入細(xì)胞壁，有助于瓦解細(xì)胞壁。細(xì)菌通常加入亞抑制量的*，以抑制細(xì)胞壁粘肽組分的合成，有利于酶對(duì)細(xì)胞壁的水解作用。

⑥酶系和酶濃度各種微生物由于細(xì)胞壁的組成不同，用于水解細(xì)胞壁的酶的種類也不相同。細(xì)菌和放線菌細(xì)胞壁的主要成分是肽聚糖，可以用*來水解細(xì)胞壁。真菌細(xì)胞壁組成較復(fù)雜，常用蝸牛酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶等來水解細(xì)胞壁。

    不同的微生物對(duì)酶的濃度要求也有差異。一般來說，酶濃度增加，原生質(zhì)體的形成率也增大，但超過一定范圍后，酶濃度增加對(duì)原生質(zhì)體形成率的提高不明顯。酶濃度過低．不利于原生質(zhì)體的形成；酶濃度過高，則導(dǎo)致原生質(zhì)體再生率降低。因此，建議以使原生質(zhì)體形成率和再生率之積達(dá)到zui大時(shí)的酶濃度作為酶濃度。

⑦酶的作用溫度和pH值酶的作用溫度和pH要根據(jù)酶的特性和菌種特性決定。

⑧酶解時(shí)間原生質(zhì)體的形成與酶解時(shí)間密切相關(guān)，酶解時(shí)問過短，原生質(zhì)體形成不*，會(huì)影響原生質(zhì)體間的融合；酶解時(shí)間過長(zhǎng)，原生質(zhì)體的質(zhì)膜也易受到損傷，從而影響原生質(zhì)體的再生，也不利于原生質(zhì)體的融合。

⑨菌體密度為了提高原生質(zhì)體的得率，還要注意酶液中菌體密度。對(duì)絲狀菌一般3mL酶液中加人300mg新鮮菌絲體較合適，過多過少都難以得到zui大量的原生質(zhì)體。

⑩酶解方式酶解方式也會(huì)影響原生質(zhì)體的形成。酶解過程要經(jīng)常輕微搖動(dòng)混合液，這不僅能使菌絲體不斷地接觸新鮮酶液，而且能補(bǔ)充氧氣，有利于原生質(zhì)體的釋放。

(2)原生質(zhì)體形成率的測(cè)定鑒于原生質(zhì)體在低滲的蒸餾水中比未破壁的正常細(xì)胞容易破裂，而且在普通培養(yǎng)基中也難以再生細(xì)胞壁和形成菌落，因此可用多種方法測(cè)定原生質(zhì)體形成率。

①適合于細(xì)菌和酵母菌的測(cè)定方法。

a.用*分別計(jì)算蒸餾水加入前(以A表示)和蒸餾水加人后(以B表示)的細(xì)胞總數(shù)，則原生質(zhì)體形成率可用下式計(jì)算：

b．把加入蒸餾水前(A)和加入蒸餾水后(B)的菌體混合物，分別涂布于高滲再生培養(yǎng)基上，計(jì)數(shù)菌落數(shù)，則原生質(zhì)體形成率可用下式計(jì)算：

②適合于霉菌和放線菌的測(cè)定方法 由于這些菌酶解后的原生質(zhì)體成串成堆．而且未脫壁細(xì)胞又是絲狀體，所以不宜直接用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)?？捎萌缦路椒y(cè)定。

a.把已原生質(zhì)體化的菌體混合液，分別等量懸浮于高滲溶液(A)和蒸餾水(B)中，然后涂布于高滲的再生培養(yǎng)基上，計(jì)數(shù)菌落數(shù)，則原生質(zhì)體形成率可用下式計(jì)算：

b.把原生質(zhì)體化的菌體混合液懸浮于高滲溶液中，分別涂布于高滲再生培養(yǎng)基(A)和普通瓊脂培養(yǎng)基(B)上，計(jì)數(shù)菌落數(shù)，則原生質(zhì)體形成率可用下式計(jì)算：