ImmunoClone

ImmunoClone使用His-tag有下面優(yōu)點(diǎn)：

1.標(biāo)簽的分子量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分別為~26KD和~30KD，一般不影響目標(biāo)蛋白的功能；

2.His標(biāo)簽融合蛋白可以在非離子型表面活性劑存在的條件下或變性條件下純化，前者在純化疏水性強(qiáng)的蛋白得到應(yīng)用，后者在純化包涵體蛋白時(shí)特別有用，用高濃度的變性劑溶解后通過(guò)金屬螯和親和層析去除雜蛋白，使復(fù)性不受其它蛋白的干擾，或進(jìn)行金屬螯和親和層析復(fù)性；

3.His標(biāo)簽融合蛋白也被用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA相互作用研究；

4.His標(biāo)簽免疫原性相對(duì)較低，可將純化的蛋白直接注射動(dòng)物進(jìn)行免疫制備抗體；

5.可應(yīng)用于多種表達(dá)系統(tǒng)，純化的條件溫和；

6.可以和其它的親和標(biāo)簽一起構(gòu)建雙親和標(biāo)簽。

蛋白標(biāo)簽都需要去除嗎？

一般為了不影響目的蛋白的后續(xù)應(yīng)用，都會(huì)選擇一定的方式將表達(dá)時(shí)帶上的各種標(biāo)簽去除。所以在設(shè)計(jì)構(gòu)建載體時(shí)可以在標(biāo)簽蛋白和外源蛋白之間加上蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)，這樣表達(dá)純化得到融合有標(biāo)簽的目的蛋白后通過(guò)蛋白酶切的方式將標(biāo)簽去除，得到完整的目的蛋白。這些常用的蛋白酶位點(diǎn)有：HRV 3C蛋白酶切位點(diǎn)、TEV蛋白酶切位點(diǎn)、腸激酶切位點(diǎn)、SUMO蛋白酶切位點(diǎn)等。但是也有幾點(diǎn)需要說(shuō)明：

1）這些酶切位點(diǎn)特異性都比較高，但切割效率各不相同；

2）除了SUMO蛋白酶之外，其它常用蛋白酶切除標(biāo)簽后都會(huì)殘留幾個(gè)氨基酸殘基。SUMO蛋白酶識(shí)別的是SUMO標(biāo)簽的空間結(jié)構(gòu)，然后將這個(gè)標(biāo)簽完整切除，不會(huì)留下多余的氨基酸殘基；

3）蛋白酶的切割效率也受識(shí)別位點(diǎn)附近的氨基酸殘基性質(zhì)的影響，具體可以參見有關(guān)文獻(xiàn)；

4）有些標(biāo)簽比較小，免疫原性也很弱，一般不用切除，也不會(huì)對(duì)后續(xù)研究和應(yīng)用產(chǎn)生影響，可以不必切除。但是有些大的標(biāo)簽，如Dsb蛋白、FkpA蛋白、GST蛋白、SUMO標(biāo)簽等等，還是需要切除的。

蛋白標(biāo)簽是加在N端還是C端呢？

N-端或C-端標(biāo)記的選擇還需要根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)、定位等特性。例如對(duì)于蛋白太小容易被降解的和比較難表達(dá)的蛋白，可以利用5’端的蛋白標(biāo)簽。這樣既能保證蛋白的穩(wěn)定性，也對(duì)外源蛋白的免疫原性影響也很小，該法適用于表位篩選。如果目的蛋白是分泌蛋白，就會(huì)遇到在目的蛋白分泌到高爾基體的過(guò)程中，蛋白5’端的信號(hào)肽，會(huì)被酶切掉的問(wèn)題。這樣，你標(biāo)簽要是裝在5’端，就沒(méi)什么用了。

C端His標(biāo)簽后未馬上終止對(duì)His標(biāo)簽特性會(huì)不會(huì)有影響？

His分離純化的原理為組氨*殘基側(cè)鏈與固態(tài)的鎳有強(qiáng)烈的吸引力，可用于固定化金屬螯合層析（IMAC），對(duì)重組蛋白進(jìn)行分離純化，若C端His標(biāo)簽后未添加終止密碼子，多余的氨基酸可能會(huì)影響His標(biāo)簽的空間構(gòu)象從而影響其掛壁效果。