摘要：本文主要介紹了濁點(diǎn)萃取法、置換色譜法、親和層析法、親和色譜法、凝膠電泳、雙水相萃取等蛋白質(zhì)的分離純化技術(shù)，綜和近年來國內(nèi)外的一些研究結(jié)果，結(jié)合實(shí)際應(yīng)用的例子，分析了各種分離純化方法的優(yōu)點(diǎn)，同時指出其不足之處。文章zui后展望了蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)的發(fā)展趨勢。
　　
　　關(guān)鍵詞：分離純化蛋白質(zhì)進(jìn)展
　　
　　生物技術(shù)的發(fā)展非常迅速，基因工程、蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵工程等生物技術(shù)，已經(jīng)能設(shè)計(jì)、制造、生產(chǎn)人們急需的多種蛋白質(zhì)。和其它生物產(chǎn)品的生產(chǎn)過程一樣蛋白質(zhì)的生產(chǎn)過程一般也分為上、中、下游過程。上、中游過程是運(yùn)用生物技術(shù)生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物，下游過程是指對含有目標(biāo)產(chǎn)物的物料進(jìn)行處理、分離、純化、加工目標(biāo)產(chǎn)物。本文主要綜和近年來國內(nèi)外的研究結(jié)果，介紹了蛋白質(zhì)的分離純化技術(shù)。
　　
　　2.蛋白質(zhì)的分離純化方法：
　　
　　2.1濁點(diǎn)萃取法（CPE）：
　　
　　2.1.1概念及原理：
　　
　　濁點(diǎn)萃取法（cloudpointextraction，CPE）〔1〕是近年來出現(xiàn)的一種新興的液—液萃取技術(shù)，它不使用揮發(fā)性有機(jī)溶劑，不影響環(huán)境。它以中性表面活性劑膠束水溶液的溶解性和濁點(diǎn)現(xiàn)象為基礎(chǔ)，改變實(shí)驗(yàn)參數(shù)引發(fā)相分離，將疏水性物質(zhì)與親水性物質(zhì)分離。目前該法已成功地應(yīng)用于金屬螯合物、生物大分子的分離與純化及環(huán)境樣品的前處理中[2-5]。
　　
　　CPE法除了利用增溶作用外，還利用了表面活性劑另一個重要性質(zhì)——濁點(diǎn)現(xiàn)象。溶液靜置一段時間（或離心）后會形成兩個透明的液相：一為表面活性劑相（約占總體積的5％）；另一為水相（膠束濃度等于CMC）。外界條件（如溫度）向相反方向變化，兩相便消失，再次成為均一溶液。溶解在溶液中的疏水性物質(zhì)如膜蛋白，與表面活性劑的疏水基團(tuán)結(jié)合，被萃取進(jìn)表面活性劑相，親水性物質(zhì)留在水相，這種利用濁點(diǎn)現(xiàn)象使樣品中疏水性物質(zhì)與親水性物質(zhì)分離的萃取方法就是濁點(diǎn)萃取。圖1顯示了由溫度變化引發(fā)的這種相分離現(xiàn)象。溫度的改變，引起水化層的破壞，增強(qiáng)了表面活性劑的疏水性。
　　
　　2.1.2蛋白質(zhì)分離純化中的應(yīng)用：
　　
　　CPE法可用于分離膜蛋白、酶、動物、植物和細(xì)菌的受體，還可以替代一些分離方法如硫酸銨分級法作為純化蛋白的*步，與色譜方法聯(lián)用。另外，CPE法分離純化蛋白質(zhì)已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模操作。Minuth等人成功地進(jìn)行了*氧化酶濁點(diǎn)萃取的中試研究。雖然使用離心分離器可以使CPE大規(guī)模連續(xù)進(jìn)行，但商品離心分離器用于CPE的效率和容量仍需進(jìn)一步研究。而且，他們發(fā)現(xiàn)相分離操作受細(xì)胞培養(yǎng)時產(chǎn)生的表面活性物質(zhì)影響較大，體系兩相間密度差較小，表面張力較小，含產(chǎn)物的表面活性劑相的流變學(xué)行為較復(fù)雜，操作較難。表1列出了CPE法近幾年來在蛋白質(zhì)分離純化中的應(yīng)用。
　　
　?。?）CPE法用于分離純化膜蛋白
　　
　　膜蛋白（內(nèi)嵌膜蛋白、外圍膜蛋白）硫水性強(qiáng)、難溶于水，抽提內(nèi)嵌膜蛋白時，既要削弱它與膜脂的硫水性結(jié)合，又耍使它保持硫水基在外的天然狀態(tài)，較難分離純化。由于表面活性刑具有兩親性，它一直作為腹蛋白理想的增溶劑。增溶時，膜蛋白琉水部分嵌入膠束的硫水核中而與膜脫離，又保持了膜蛋白表面的廢水結(jié)構(gòu)。相分離后，膜蛋白與表面活性劑共同析出，與親水性蛋白質(zhì)分離。所以，CPE法在分離純化膜蛋白方面極有優(yōu)勢。
　　
　?。?）與其它分析技術(shù)的聯(lián)用
　　
　　CPE可以作為液相色譜（HPLC）、流動注射分析（FIA）、毛細(xì)管電泳（CE）等儀器分析的樣品前處理方法，提高檢出靈敏度。表面活性別可以防止樣品吸附在玻璃容器上，易于與FIA中的載液及HPLC中的有機(jī)流動相或膠束流動相混合，可以直接進(jìn)樣。但是在很多應(yīng)用中需要除去表面活性劑后再與儀器聯(lián)用。將萃取物與表面活性劑分離的方法很多。對于CMC＞1mM的表面活性劑如兩性離子表面活性劑可用透析法，但操作時間較長（24h左右）。對于CMC較小的表面活性劑可通過色譜柱分離除去，如凝膠柱、毛紉管柱等，分離出的表面活性劑可以再利用，也可以作焚燒處理。但CPE作為HPLC的樣品前處理方法有兩個缺點(diǎn)：*，常用的表面活性劑在UV區(qū)域有很強(qiáng)的背景吸收。第二，操作時間較長，從色譜柱上需用幾個小時洗脫表面活性劑。表面活性劑的洗脫可能會干擾分析物的測定[3]。
　　
　　2.2置換色譜法：
　　
　　2.2.1概念及分離機(jī)理：
　　
　　置換色譜（displacementchromatography）〔6〕作為一種非線性色譜技術(shù)，是指樣品輸入色譜柱后，用一種與固定相作用力*的置換劑（displacer）通人色譜柱，去替代結(jié)合在固定相表面的溶質(zhì)分子。樣品在置換劑的推動下沿色譜柱前進(jìn)，使樣品中各組分按作用力強(qiáng)弱的次序，形成一系列前后相鄰的譜帶，并在置換劑的推動下流出色譜柱[7]。置換色譜的分離行為與樣品組分和置換劑在實(shí)驗(yàn)條件下的吸附等濕線有直接的。置換色譜要求樣品組分及置換劑的吸附等濕線應(yīng)為Langmuir型，而且置換劑相對于被分離的各組分應(yīng)有zui強(qiáng)的吸附能力，其吸附等溫線位于所有組分的吸附等溫線的上方[7]，見圖1（A）。根據(jù)物料平衡方程，置換劑在柱中的移動速度uD有下列關(guān)系：
　　
　　式中uD為流動相的線速，ф為相比，qD和cD分別為置換劑在固定相和流動相中的濃度，qD／cD是直線OD的斜率，稱之為操作線（operatingline）。當(dāng)操作線的斜率小于被分離組分等溫線的起始斜率，樣品才能進(jìn)行置換展開，zui終形成如圖l（中的置換序列，這是在理想的情況下（假定無軸向擴(kuò)散及二次化學(xué)平衡）獲得的置換色譜圖。每一組分形成矩形的平臺（Plateau）洗脫峰，相鄰各組分的平臺洗脫峰組成了一個臺階
　　
　　狀的色譜圖。此時，樣品中不同的組分以置換劑的速度前進(jìn)，即達(dá)到等速狀態(tài)（isobathicconditions）：
　　
　　uD＝u2；u3＝u4
　　
　　式中u2、u3、u4指被置換的三組分的速度
　　
　　2.2.2影響置換色譜分離的因素：
　　
　　（1）置換劑
　　
　　置換劑的選擇是置換色譜能否成功地分離和純化目標(biāo)產(chǎn)物的關(guān)鍵因素之一〔7,8〕。對于蛋白質(zhì)生物大分子的置換色譜來說，多離子型的置換劑與離子交換續(xù)料相結(jié)合是目前常用的分離方式。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為分子量相對大的聚電解質(zhì)是較合適的置換劑，因?yàn)樗鼈儗潭ㄏ嗟慕Y(jié)合比分離物更強(qiáng)，如羧甲基葡聚糖（CMD）、
　　
　　硫酸葡聚糖、羧甲基淀粉（CMS）〔9〕、硫酸魚精蛋、肝素、多硫酸戊聚糖（PPS）等。近期的研究表明，低分子量的化合物作為置換劑則更有優(yōu)勢，因?yàn)榧词怪脫Q劑與蛋白質(zhì)產(chǎn)物的峰有疊加，在后處理過程中，低分子量置換劑則較容易從目標(biāo)產(chǎn)物中分離；同時，合成低分子量置換劑成本較低，色譜柱再生過程也比分子量大的置換劑快。
　　
　　（2）固定相
　　
　　理想的固定相應(yīng)具備以下條件：樣品及置換劑在固定相上應(yīng)有較強(qiáng)的吸附作用，且吸附是可逆的；樣品及置換劑在固定相上的吸附等溫線應(yīng)為Langmuir型；樣品各組分在固定相上的吸附能力應(yīng)有較大差別，以保證置換色譜帶的交疊部分盡可能小而獲得良好的產(chǎn)率；有較好的化學(xué)穩(wěn)定性，可適用于不同pH值的緩沖液和有機(jī)溶劑；有較大的比表面及吸附容量；有較好的機(jī)械強(qiáng)度，而且容易再生。置換色譜中的環(huán)境不同，置換效果也不一樣，即使是選用同樣的硅膠，由于來源和制備方法上的差異也會影響置換效率。反相
　　
　　色譜中使用的烷基硅膠柱常被應(yīng)用于置換色譜。同其它硅膠固定相相比，烷基硅膠柱由于柱容量低及非選擇性吸附等缺點(diǎn)，很少被用于洗脫色譜，但它卻可以用于置換色諾，并成功地分離了對映異構(gòu)體。
　　
　　1、問題：電滲純化蛋白質(zhì)，結(jié)果幾乎沒得到蛋白，請問哪位有高見今夜純化蛋白，本以為唾手可得，結(jié)果卻大失所望....我用SDS-PAGE分離，KCL顯帶，割膠，而后電滲分離，測OD值極低，請問哪位有這方面的經(jīng)驗(yàn)或其它方法，望賜教。解決：多挖點(diǎn)膠，收集起來，放在1.5離心管里，用PBS搗爛，4度過夜。然后離心，收集上清即可。zui后，把上清凍成干粉。
　　
　　2、問題：蛋白質(zhì)提純的方法：
　　
　　SDS-PAGEandN-terminalaminoacidsequenceanalysis.（dahuaidang）SDSpolyacrylamidegelelectrophoresis（SDS-PAGE）wasperformedin12%acrylamideand0.1%SDSwithadiscontinuousTris-glycinebuffersystem.PurifiedenzymewassubjectedtoSDS-PAGEandelectroblottedtoImmobilo-PSQ0.45μmpolyvinylidenefluoridemembrane（Millipore）.Afterthemembranewasstainedwith
　　
　　PonceauS（Sigma）,theenzymeproteinwascutoutandwashedwithmethanol.ThemembranestripholdingtheproteinwassubjectedtoautomaticEdmandegradationforsequencingoftheN-terminalaminolacidsusingan
　　
　　AppliedBiosystems477Aproteinsequencer（ParkinElmer）.
　　
　　3、問題：蛋白質(zhì)純化，裝柱，過柱應(yīng)注意事項(xiàng)有哪些？（dahuaidang）
　　
　　現(xiàn)在要進(jìn)行蛋白質(zhì)純化，有關(guān)裝柱和過柱的注意事項(xiàng)有哪些呀？還有，需要測序的蛋白質(zhì)樣品，大概需要多少，樣品要求有哪些。柱子sephadex-200,和DEAE-纖維互素。
　　
　　*，手工裝柱一般只適宜于大量蛋白質(zhì)的提取。分子篩柱一般在鹽析以后用效率才高，因?yàn)樗姆宙聦?shí)汀Ｒ話鬮葉莢蕹捎茫齲校蹋彌潁疲校蹋彌?Gelfitrationcolumn）.如果手工裝柱，長度應(yīng)是內(nèi)徑的６０－８０倍，一般柱長應(yīng)在1.2-2米，對于軟膠，走一次柱須１２小時以上，對硬膠，也需５－６小時。
　　
　　第二，儀器檢測器靈敏度調(diào)整：zui重要的是確定儀器工作正常，信號相應(yīng)正常?？捎迷跈z測器出口通氣泡和檢測器入口注射有色樣品的方法確認(rèn)儀器正常和估計(jì)靈敏度。
　　
　　第三，均勻,無氣泡，平衡充分，分子篩要注意長度與直徑比。測序的蛋白量'我用的方法的量是SDS-PAGE
　　
　　第四，如果是測序的話,跑SDS-PAGE,把染出的蛋白質(zhì)帶,挖下來.,直接拿去做質(zhì)譜,只要你有錢國家生物醫(yī)學(xué)分析中心。還有就是要保證挖的是一個蛋白質(zhì)帶,不能含雜蛋白質(zhì)的,不然,把雜蛋白質(zhì)測了怎么辦。
　　
　　第五，測序跟質(zhì)譜不是一回事兒的。做質(zhì)譜可以做分子量和質(zhì)譜圖，但是未必是序列。序列是要單測的。北大有位老師可以做：180塊錢一個氨基酸。做質(zhì)譜多得是：測分子量大約是450塊錢了，測圖譜的要一千多塊。
　　
　　4、問題：跑SDS-PAGE有好多帶，而過柱時卻沒有峰，原因是什么？
　　
　　1、會不會是洗脫太快。
　　
　　2、查查有沒有斷層。
　　
　　3、SDS-PAGE分離能力強(qiáng),而在柱子FRACTION中幾個低峰依次串在一起就不明顯了。
　　
　　4、上柱前樣品要濃縮，保證樣濃度不能太低。如沒濃縮，檢測儀的量程又沒選好，可能看不出來。
　　
　　5、Sephadex是Amersham公司經(jīng)典的層析填料，有很高的選擇性，不同顆粒大小的填料有不同的分離范圍，主要用于凝膠層析（亦稱分子篩）。粗顆粒流速較快，細(xì)顆粒流速較慢，但分辨率較高。Sephadex200的分離范圍（以球蛋白計(jì)）是5－60kDa。這種填料的另一個優(yōu)點(diǎn)是較便宜。（也夠貴的）現(xiàn)已被新一代Bioprocess填料代替。
　　
　　DEAE--纖維素我沒用過，應(yīng)該是用于離子交換吧。這是一種弱陰離子填料。
　　
　　以下情況都是正常的：
　　
　　1，沒有峰的部位有帶?？赡芪盏蜕蠘恿可倩蛘邫z測手段不對頭（zui麻煩，好像只好分部收集了，但是一般情況下，首先考慮的是找到更合適的檢測手段）。
　　
　　2，一個很好的峰的部位有很多帶。這個就沒有必要解釋了。
　　
　　3，有峰的部位沒有帶?？赡苁怯凶贤馕盏男》种蛘呓到獾亩屉模ㄟ@個zui可恨）或者在電泳中間分子量太小跑到頂端了等等。
　　
　　4，同一個蛋白出現(xiàn)在不同的部位。在離子交換中可能是電荷分布不對稱。上面的所有的還有一個可能就是柱子有問題，那我就不好說了。但是我用到的都是世界上的公司的預(yù)裝柱，所以我就不考慮了。還有的情況是上面的1、4同時出現(xiàn)，那真是要把人氣死！?。≈劣谡f拖尾，刺峰等等都很常見。而且首先大概就是考慮柱子效率下降了或者壞了。呵呵?。?！
　　
　　5、樣品濃度多少才不算低？0.8mg/ml的蛋白質(zhì)濃度算不算低。我不太想用透析袋濃縮，那樣會丟失好多樣品。想直接加樣，洗脫。還有，上樣體積問題？2.6*96cm柱子，上100ml的樣品怎么樣？zui后一個問題，樣品中含有少量edta會不會有影響？
　　
　　1、如果是離子交換，上樣濃度太大反而不好，這樣子動態(tài)載量會減?。?br />　　
　　2、如果是凝膠層析，上樣濃度要盡量大些，道理和電泳一樣，樣品在跑的過程中不可避免地會被稀釋，變得"broad"，雜質(zhì)和目標(biāo)蛋白的洗脫峰就有更多的部分重疊，影響純度。
　　
　　3、關(guān)于凝膠層析的上樣量，通常是柱體積的2－5％，太多會影響分離效果。你的上樣量顯然太大了。在現(xiàn)有條件下，可以通過連續(xù)批次上樣，即不等前次樣品跑出柱子，就第二次上樣，通?？梢宰龅揭粋€柱體積上兩次樣，這樣子可以節(jié)省時間和試劑。但要具體摸索。
　　
　　4、至于量程的設(shè)定，我建議先用緩沖液回零，再用注射器或泵將樣品注入檢測器，調(diào)至滿刻度，應(yīng)該差不多了。
　　
　　5、edta是常用的生物緩沖液的成分之一，它在某些情況下會影響層析，具體情況具體分析。
　　
　　6、什么叫連續(xù)批次上樣？具體我應(yīng)該怎么fumble呀，我還從沒聽說過這個詞呢。還望指教。
　　
　　一般情況下，上柱的樣品跑出柱子后，根據(jù)紫外或電導(dǎo)或其他檢測器的情況分部收集完成后，才開始第二次上樣，需要用至少一個柱體積的緩沖液。這種情況下，絕大部分緩沖液是用于將樣品“沖”出柱子，尤其是后半部分的緩沖液。有些浪費(fèi)。這部分緩沖液的*可以再上一次樣品，適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)兩次上樣的間隔，可以做到兩次樣品*分開而不會重疊，從而一個柱體積的洗脫中可以兩次上樣，節(jié)省試劑，縮短時間，
　　
　　即所謂“連續(xù)批次”。這是相對通常情況下而言的。
　　
　　7、例子：樣品是用10mMTris-Cl,pH7.4（含10mMEDTA）,而流洗緩沖是30mMTris-Cl,pH7.9,我自己認(rèn)為這樣應(yīng)該不會有太大影響吧，希望有知情者告知。好讓我下次改正。
　　
　　分析：根據(jù)你的描述，看來你是在用Sephadex26/100做凝膠層析。
　　
　　1、凝膠層析主要用途有兩個，一個是在其分辨率范圍內(nèi)根據(jù)分子大小進(jìn)行分離，常用于蛋白質(zhì)純化的zui后一步，即精細(xì)純化（polishing），由于樣品體積明顯影響分離速度和分辨率，故很少用于粗提純。另一個用途是脫鹽/緩沖液置換，即將蛋白或其他大分子量的組分與無機(jī)鹽等小分子組分分開。常用于不同層析步驟之間的緩沖液置換，使得樣品與待使用的緩沖液成分盡量一致。目前Amersham公司的填料中SephadexG25較常用于這方面。
　　
　　2、如果你的凝膠柱子用于蛋白質(zhì)的分離純化，如我前所提，分辨率至關(guān)重要。裝柱的效果直接影響分離效果。裝得不好的柱子是對填料的浪費(fèi)，尤其是用好的凝膠。不知道你是否測過這個柱子的柱效？合格的SephadexG100柱子的每米理論塔板數(shù)應(yīng)在3000－6000之間。如果低于3000，重裝。
　　
　　3、平衡也很重要。柱子裝完后，要用和上樣緩沖液盡量相同的緩沖液平衡，流速也與上樣盡量一致，平衡至少5個柱體積，讓填料“喝飽”，即流出的液體和進(jìn)的液體成分盡量一致，有時紫外檢測器的走線平穩(wěn)并不一定意味著平衡完成即是如此。連續(xù)上樣過程中，也要適當(dāng)進(jìn)行平衡，比如3－5次上樣后平衡2個柱體積，對柱子的分離效果和壽命都有好處。
　　
　　8、問題：823a型紫外檢測儀——3057型便攜式記錄儀。我不明白這種組裝是啥道理？是通過什么信號使得記錄儀能夠記錄到，由檢測器檢測出的信息。所以我在操作時，不知道怎么調(diào)節(jié)。那些按鈕之間的關(guān)系？
　　
　　1.短接記錄儀，記錄筆應(yīng)回到機(jī)械零位，否則調(diào)之；
　　
　　2.接通檢測器，檢測器中充滿1mg/ml的蛋白質(zhì)溶液（如Albumin），調(diào)節(jié)檢測器的信號輸出（通常是用電壓標(biāo)識mv），使記錄筆接近100％滿刻度；
　　
　　3.檢測器中充滿緩沖液，看記錄筆的位置，接近～10％刻度的地方，這樣防止出現(xiàn)吸光度值低于緩沖液無法記錄的情況；如果筆位太高，應(yīng)增大檢測器信號輸出，重新按步驟2調(diào)節(jié)；反之降低信號輸出；有的記錄儀也可調(diào)節(jié)輸入信號的范圍，這樣子就更方便了。滿刻度的調(diào)節(jié)要視具體應(yīng)用，不一定是1mg/ml的蛋白濃度。
　　
　　9、aboutdimensionofcolumn:（davidzrock）
　　
　　"Thechoiceofinnerdiametermaybebasedonthedesiredsampleloadoronconsiderationsoftheextra
　　
　　dispersion
　　
　　effectsfromthewallregion,whichextends20particlediametersawayfromthewall....Thelengthofthecolumn
　　
　　isprimarilychosenaccordingtotheresolutionthatisrequired."
　　
　　"Thedimensionsmaybechosenaccordingtotheapplicationathand,butmostlaboratorycolumnshavea4-to
　　
　　16-mminnerdiameter（i.d.）andalengthof25to70cm."
　　
　　-----From‘ProteinPurificationprinciples,HighResolutionMethods,andApplications’2ededitedbyJ.C.Janson
　　
　　andL.Ryden
　　
　　"Theresolutionoftwoseparatedzonesingelfiltrationincreasesasthesequarerootofcolumnlength.Long
　　
　　columnsshould,therefore,beusedtoobtainthebestresolutioninanalyticalfractionation.Bedheightsofgreater
　　
　　than1mareseldomrequired.Ifaverylongbedisjudgedtobenecessary,theeffectivebedheightcanoftenbe
　　
　　increasedsimplybyrecyclingorbyusingcolumnscoupledinseries."
　　
　　從amersham商品化提供的預(yù)裝柱能看到，沒有超過1m的。很長的柱子裝填難度極大。裝得好的柱子一根可以當(dāng)兩根用。
　　
　　關(guān)于手工裝柱，取決于裝柱操作者的經(jīng)驗(yàn)，*可以比預(yù)裝柱的效果好，而且可以根據(jù)試驗(yàn)的具體情況改變柱子參數(shù)。但預(yù)裝柱的優(yōu)點(diǎn)是方便、省事，很適合對柱子和填料進(jìn)行"scaning"。另外工業(yè)化的層析要求是重復(fù)性，“對人是不信任的”，而不要求的效果，只要滿足要求即可。這時就要有裝柱設(shè)備（packingstation）了?，F(xiàn)應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的凝膠層析柱直徑已超過1m。
　　
　　10、在室溫下的柱子，怎么保證其膠不發(fā)霉
　　
　　1.柱子裝填和使用過程中要注意減少微生物的污染，如對緩沖液和樣品等進(jìn)行澄清、除菌過濾。低溫并不能保證無菌生長。
　　
　　2.柱子在使用過程中，要定期進(jìn)行在位清洗/消毒（SIP/CIP，sanitization/cleaninplace）。如1MNaOH處理1hr，可有效地減少微生物污染。具體使用哪種消毒劑以及消毒方法，請參閱凝膠及空柱使用說明書，避免損害凝膠柱。如你沒有，我可幫你查。
　　
　　3.柱子長期不用時，為防止微生物生長，建議在位保存。如用10mMNaOH或20％乙醇將柱內(nèi)的液體全部置換出來，存放在建議溫度下（不一定是低溫）。使用前再進(jìn)行沖洗和平衡。也可將凝膠取出，保存于上述溶液中。
　　
　　4.如有微生物生長，應(yīng)進(jìn)行滅菌處理，如1MNaOH或取出凝膠進(jìn)行高溫滅菌，具體方法亦需事先參閱說明書。
　　
　　FromAmersham
　　
　　Antimicrobialagentsforchromatography
　　
　　Aqueousbuffersolutionswilloftensupportgrowthofmicro-organismscommonlyfoundinlaboratories.Sinceitisdifficulttocleancolumnsthathavebecomeheavilycontaminatedwithmicroorganisms,precautionsshouldbetakentoavoidgrowthinthecolumnorinbuffervessels.Alwaysusefreshbuffersolutionsandcoverthebuffervesselstokeepoutdust,sporesandotherparticles.Ifacolumnwillnotbeusedformorethanacoupleofdays,itshouldbeequilibratedwiththebacteriostaticagentdescribedinthemanualsuppliedwiththeseparationmediumorprepackedcolumn.Werecommendethanolorsodiumhydroxideforgeneraluse.Theseagentsareeffective,inexpensiveanddonotcausedisposalproblems.Ethanol20%ManychromatographymediafromAmershamBiosciencesaresuppliedasasuspensioncontaining20%ethanol.Ethanol,20%,canalsobeusedasanalternativetoNaOHforstoringchromatographymediaunderbacteriostatic
　　
　　conditions.ItshouldnotbeusedforcolumnspackedwithSephadexG-typesandothermediabasedonSephadexsincethebedwillshrinkandspoilthepacking.SodiumhydroxideSodiumhydroxide,0.01M,isaneffectivebacteriostaticagent.Athigherconcentrations（0.5-1.0M）itisan
　　
　　effectivesanitizingagentforcontaminatedcolumns.Forthemostfrequentcontaminantsinchromatographicsystems,suchasgram-negativebacteria,agoodbactericidaleffectisreachedevenatconcentrationsaslowas
　　
　　0.01MNaOH.Treatmentwithsodiumhydroxideinactivatesendotoxins（LPS）andwill,inmanycases,solubilizesubstancesprecipitatedonthecolumn.Itslowtoxicityisanadvantagethatreducestheriskofsamplecontamination.SodiumhydroxideisnotrecommendedforusewithSepharoseorforstorageofSephacrylHR.
　　
　　11、層析關(guān)于裝柱和使用，主要有幾點(diǎn)要注意的：（davidzrock）
　　
　　1、裝柱前要仔細(xì)看填料的使用說明書，每種填料都有自己的特性，以及特殊的裝柱方法，針對不同的空柱，也要注意方法可能不同；2、填料要加水?dāng)嚢璩删鶆驊乙?，懸液濃度依填料而不同，一?0－85％，迅速倒入空柱內(nèi)，或吸或壓，流速和具體步驟看說明書。
　　
　　3、這一點(diǎn)非常重要：裝柱包括以后使用中不允許柱內(nèi)進(jìn)入氣泡（bubblefree），柱頭事先也要排除氣泡。
　　
　　4、選擇合適的泵，首先是流速滿足要求，脈沖盡量小。柱塞泵。
　　
　　5、所有柱子盡量做到填料均勻，尤其是用于凝膠層析的柱子。裝柱完成后，可用柱效測定的方法檢查裝填效果。一個裝填合格的柱子的理論塔板高度應(yīng)是填料平均粒徑的2－4倍，在此范圍內(nèi)越小越好。
　　
　　6、準(zhǔn)備上柱的液體應(yīng)進(jìn)行過濾，至少是0.45micrometre。
　　
　　7、至于測序，我想大概不到1mg應(yīng)該足夠了。
　　
　　8、關(guān)于純化，首先要考慮的是你的目標(biāo)：純度、數(shù)量、速度、收率等等，再根據(jù)樣品的具體情況，尤其是目標(biāo)蛋白的性質(zhì)，確定純化策略。通常三步曲：capture、purification、polishing。*步先從大量或復(fù)雜樣品中將目標(biāo)蛋白“抓出”，與主要雜質(zhì)分離；再用高選擇性的層析去除絕大部分雜質(zhì)；zui后精細(xì)純化，提供純度至設(shè)定目標(biāo)。到實(shí)際工作中，不要死靠三步，也許一步也許四步或更多，具體情況具體分析。所謂“三步”只是一種思路而已。上海友騰生物傾力為客戶提供上萬種科研試劑，提供*、zui全、zui有效的科研試劑產(chǎn)品，質(zhì)量被全國各大院?？蒲袡C(jī)構(gòu)認(rèn)可。
　　
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