泛柯為您分析Elisa免疫標(biāo)記技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理

     上海泛柯實(shí)業(yè)有限公司以為客戶提供的產(chǎn)品和服務(wù)而自豪。我們擁有經(jīng)驗(yàn)豐富的化學(xué)師嚴(yán)格控制化學(xué)品的質(zhì)量。我們的技術(shù)服務(wù)人員隨時(shí)可以回答您有關(guān)產(chǎn)品的任何問(wèn)題。我們還有一支專業(yè)的銷售團(tuán)隊(duì)正在為向客戶提供100%的滿意服務(wù)而不斷努力著。下面就由本公司為您講解： 

     為提高抗原和抗體檢測(cè)的敏感性，將已知抗體或抗原標(biāo)記上易顯示的物質(zhì)，通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記物，反映有無(wú)抗原抗體反應(yīng)，從而間接測(cè)出微量的抗原或抗體。常用的標(biāo)記物有酶、熒光素、放射性同位素、膠體金及電子致密物質(zhì)等。這種抗原或抗體標(biāo)記上顯示物所進(jìn)行的特異性反應(yīng)稱為免疫標(biāo)記技術(shù)（immunolabelling technique）。

1.原理

辣根過(guò)氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）

辣根過(guò)氧化物酶 （horse radish peroxidase，簡(jiǎn)稱HRP，EC.1.11.1.7）是植物中研究得zui深入的一種過(guò)氧化物酶，早在20世紀(jì)30年代就有人著手從辣根中分離此酶，以后又制備出結(jié)晶。本實(shí)驗(yàn)是以辣根為原料，經(jīng)過(guò)水的抽提，硫酸銨和丙酮分級(jí)分離，再經(jīng)鋅離子純化，透析除鹽，冰凍干燥，便可得到高純度的辣根過(guò)氧化物酶。

辣根過(guò)氧化物酶是一種含亞鐵血紅素的蛋白質(zhì)，HRP廣泛分布于植物界，它是由無(wú)色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結(jié)合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多個(gè)同功酶組成，Mr在40000左右，等電點(diǎn)7.2。溶于水，溶解度為5%（W/V），溶液呈棕紅色，透明。酶催化的zui適PH因供氫體不同而稍有差異，但多在pH5左右。酶溶于水和58%以下的硫酸銨溶液。HRP可溶于0.58飽和度以下的硫酸銨溶液，而0.62飽和度以上則不溶。該酶zui適pH7.0（對(duì)愈創(chuàng)木酚為氫給體而言）。在室溫下，HRP幾周內(nèi)穩(wěn)定，加熱到63℃，在15min內(nèi)穩(wěn)定。氧化還原電勢(shì)很低，pH6.08時(shí)，E 0 =-0.2070V，pH為7.71時(shí)，E′0 =-0.2787V。HRP的輔基和酶蛋白zui大吸收光譜分別為403nm和275nm，一般以OD403nm/OD275nm的比值RZ（德文Reinheit Zahl）表示酶的純度。* ?# p. n2 ~1 w. X3 b

酶標(biāo)記物包括酶標(biāo)記抗原、酶標(biāo)記抗體和酶標(biāo)記SPA等。酶標(biāo)記物質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到免疫酶技術(shù)的成功與否，因此被稱為關(guān)鍵的試劑。酶標(biāo)記物中zui常用的是酶標(biāo)記抗體，它是將酶與特異性抗體經(jīng)適當(dāng)方法連接而成。酶標(biāo)記抗體的質(zhì)量主要取決于純度好、活性強(qiáng)及親和力高的酶和抗體，其次要有良好的制備方法。目前，高質(zhì)量的酶（如辣根過(guò)氧化物酶，簡(jiǎn)稱HRP）國(guó)內(nèi)已有商品供應(yīng)。高質(zhì)量的抗體則可通過(guò)提取純化而獲得。在制備方法上，宜選用產(chǎn)率高、不影響結(jié)合物的活性和不混雜干擾性物質(zhì)且操作簡(jiǎn)便易行的方法。

酶制劑及其底物

凡無(wú)毒性又能呈現(xiàn)有色化學(xué)反應(yīng)的酶，原則上均可作為標(biāo)記用。但作為標(biāo)記抗體用的酶應(yīng)滿足下列要求：

（1）來(lái)源方便，易于純化;

（2）比活性高，性質(zhì)穩(wěn)定;

（3）酶活性和量能

用簡(jiǎn)單方法測(cè)定。目前在免疫酶技術(shù)中常用的酶為辣根過(guò)氧化物酶（HRP）和鹼性磷酸酶（AP），其次還有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、*和蘋(píng)果酸脫氫酶等。

由于辣根過(guò)氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）比活性高，穩(wěn)定，分子量小，純酶容易制備，所以zui常用。HRP廣泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由無(wú)色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結(jié)合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多個(gè)同功酶組成，分子量為40,000,等電點(diǎn)為PH3～9,酶催化的zui適PH因供氫體不同而稍有差異，但多在PH5左右。酶溶于水和58%以下飽和度硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白zui大吸收光譜分別為403nm和275nm，一般以OD403nm /OD275nm的比值RZ（德文Reinheit Zahl）表示酶的純度。高純度的酶RZ值應(yīng)在3.0左右（zui高可達(dá)3.4）。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，純度并不表示酶活性，如當(dāng)酶變性后，RZ值仍可不變。

HRP的催化反應(yīng)需要底物過(guò)氧化氫（H2O2）和供氫體（DH2）。供氫體多為無(wú)色的還原型染料，通過(guò)反應(yīng)可生成有色的氧化型染料（D）。酶促反應(yīng)的過(guò)程如下:

HRP2 ~2 y（ w9 E+ M

DH2+H2O2────→D+2H2O

供氫體的種類很多，形成的產(chǎn)物特點(diǎn)不一。如DAB（3.3-二氨基聯(lián)苯胺）的反應(yīng)產(chǎn)物為不溶性沉淀物，并有電子密度，故適宜于做免疫酶染色或電鏡觀察。S（5-氨基水楊酸）早期曾用于ELISA，但其溶解度不夠大，且空白孔不易控制到無(wú)色，現(xiàn)已很少應(yīng)用。OT（鄰聯(lián)甲苯胺）的特點(diǎn)是能產(chǎn)生鮮艷的藍(lán)綠色產(chǎn)物且靈敏度較高，但反應(yīng)中受溫度影響較大，而且由于產(chǎn)物不穩(wěn)定，需要在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。目前用得較廣泛和較滿意的供氫體是：OPD（鄰苯二胺）和TMB（四甲基聯(lián)苯胺）。前者形成的產(chǎn)物為深桔黃色或棕色，后者產(chǎn)物為藍(lán)綠色，二者的可溶性均好，在避光處顏色穩(wěn)定，空白可近于無(wú)色，靈敏度上據(jù)報(bào)道后者比前者可高4倍以上。另外，還有一種供氫體稱ABTS[2, 2-邊氮基-雙（3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸）]，其反應(yīng)產(chǎn)物呈藍(lán)綠色，且靈敏度和穩(wěn)定性均好。尤其是在致癌的潛在可能性方面，ABTS與TMB皆是值得被優(yōu)選的供氫體。

由于HRP的底物H₂O₂本身又是酶的抑制劑，因此酶促反應(yīng)中使用的H2O2不能過(guò)量。應(yīng)控制在經(jīng)較短時(shí)間反應(yīng)后呈色即達(dá)高峰（說(shuō)明H2O2已消耗殆盡）。這樣即使再延長(zhǎng)時(shí)間也不會(huì)增加反應(yīng)產(chǎn)物的顏色。

酶與抗體交聯(lián)的方法有許多種,根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)不同可采用不同的方法。對(duì)于制備HRP結(jié)合物，可用戊二醛二步法和過(guò)碘酸鈉法。常用過(guò)碘酸鹽氧化法，這種方法法只適用于含糖量較高的酶。過(guò)碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基，醛基與抗體分子上的氨基形成Schiff堿而結(jié)合。后者可進(jìn)一步用NaBH4（或乙醇胺）還原生成穩(wěn)定的酶標(biāo)記抗體。

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