不管您是實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 或稱為定量 PCR (qPCR) 的新手，還是想了解實(shí)時(shí) PCR 的新應(yīng)用，我們都有相關(guān)學(xué)習(xí)材料，包括視頻和網(wǎng)絡(luò)研討會(huì)，幫助您理解這一技術(shù)并更快上手。
偽牛痘病毒染料法熒光定量PCR試劑盒PCR 將 PCR 擴(kuò)增和檢測(cè)合并為單一步驟。這樣就無需使用凝膠電泳進(jìn)行產(chǎn)物檢測(cè)，更重要的是這一方法是真正定量的。在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 中，熒光染料被用來在熱循環(huán)中標(biāo)記 PCR 產(chǎn)物。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀器在反應(yīng)的對(duì)數(shù)期測(cè)定熒光信號(hào)的積累，獲得快速精確的 PCR 產(chǎn)物定量以及客觀的數(shù)據(jù)分析。
專題資源
步驟、過程
構(gòu)建一段寡核苷酸探針：5’端標(biāo)記熒光染料報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記淬滅染料基團(tuán)。當(dāng)探針保持完整時(shí)，淬滅基團(tuán)的靠近會(huì)通過空間上的熒光共振能力轉(zhuǎn)移（FRET）而顯著降低由報(bào)告染料基團(tuán)發(fā)射的熒光。
如果存在目標(biāo)序列，探針便會(huì)在其中一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)的下游發(fā)生退火，并隨著引物的延伸通過Taq DNA聚合酶的5’核酸酶活性，完成切除。
探針的切除將會(huì)引起：
將報(bào)告染料基團(tuán)和淬滅染料基團(tuán)進(jìn)行分離，增強(qiáng)了報(bào)告染料基團(tuán)的信號(hào)。
將探針從目的鏈上去除，使引物繼續(xù)沿模板鏈末端延伸。因此，探針的介入并不會(huì)抑制整個(gè)PCR過程。
每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，就會(huì)有更多的報(bào)告基因染料分子從各自的探針上切斷，熒光強(qiáng)度會(huì)隨著合成的擴(kuò)增片段數(shù)量的增加而增加。
兩種類型的 TaqMan 探針我們可提供兩種類型的Applied Biosystems TaqMan 探針：
偽牛痘病毒染料法熒光定量PCR試劑盒TaqMan探針（含有Invitrogen TAMRA染料——淬滅染料基團(tuán)）
Applied Biosystems TaqMan MGB探針
推薦用于等位基因檢測(cè)的 TaqMan MGB 探針
我們一般推薦使用TaqMan MGB探針進(jìn)行等位基因分型分析，特別是當(dāng)傳統(tǒng)TaqMan探針超過30個(gè)核苷酸時(shí)。TaqMan MGB探針包含：
位于3’ 端的非熒光淬滅基團(tuán)——由于淬滅基團(tuán)不發(fā)出熒光，因此SDS儀可以更精確地檢測(cè)出報(bào)告基因染料 。
位于3’ 端的小溝結(jié)合物 – 小溝結(jié)合物可提高探針的熔解溫度（Tm），縮短探針的長(zhǎng)度。
終，TaqMan MGB 探針會(huì)在匹配和未匹配探針之間展現(xiàn)出更大的 Tm 值差異，從而提供更準(zhǔn)確的等位基因分型。
TaqMan 方法的優(yōu)點(diǎn)
需要在探針和目標(biāo)分子（靶點(diǎn)）之間發(fā)生特異性的水解（雜交），方可生成熒光信號(hào)
您可使用明顯不同的報(bào)告基因染料標(biāo)記探針，在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)擴(kuò)增并檢測(cè)兩個(gè)不同的序列
無需PCR后處理，減少分析工作量并節(jié)省材料成本。
TaqMan方法的缺點(diǎn)：
TaqMan方法的主要缺點(diǎn)在于需要根據(jù)不同的序列，合成不同的探針。
