短鏈脂肪酸靶標(biāo)定量(代謝組學(xué))檢測分析方案
一、項(xiàng)目簡介
1.1 短鏈脂肪酸概述
短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs),也稱揮發(fā)性脂肪酸(Volatile fatty acids,VFA),根據(jù)碳鏈中碳原子的多少,把碳原子數(shù)為1-6的有機(jī)脂肪酸稱為短鏈脂肪酸,主要包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸。
短鏈脂肪酸被后腸迅速吸收后,既儲存了能量又降低了滲透壓,并且短鏈脂肪酸對于維持大腸的正常功能和結(jié)腸上皮細(xì)胞的形態(tài)和功能具有重要作用。近端及遠(yuǎn)端結(jié)腸內(nèi)SCFAs濃度分別約120mol/L和90mol/L,其中重要且相對較多(占總量95%)的是乙、丙、丁酸,三者比例大致為3:1:1。受發(fā)酵底物、細(xì)菌種類等因素的影響,腸道內(nèi)所產(chǎn)生的短鏈脂肪酸的種類和數(shù)量不同,其發(fā)揮的作用也不盡相同。
表1. 腸道內(nèi)主要細(xì)菌數(shù)量及代謝產(chǎn)物
1.2 技術(shù)路線
圖1. 短鏈脂肪酸靶標(biāo)定量(代謝組學(xué))技術(shù)路線圖
1.3分析內(nèi)容
基礎(chǔ)數(shù)據(jù)分析包括:數(shù)據(jù)預(yù)處理,差異化合物篩選,PCA模式識別。
1.4檢測平臺
分析檢測平臺:GC-FID或GC-MS
二、檢測分析方案
2.1標(biāo)準(zhǔn)品配置
建立標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)校準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)清單見表2:
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表2. 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)列表
我們采用嚴(yán)格的質(zhì)量控制體系來保證數(shù)據(jù)的可靠性:
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表3. 質(zhì)量控制體系
說明:
⒈精密度:指用某種方法重復(fù)測定同一均質(zhì)樣品所得測定值的彼此接近程度,表示分析結(jié)果的重復(fù)性。常用標(biāo)準(zhǔn)差(SD)或相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表示。在相同條件下,由一個(gè)分析人員測定所得結(jié)果的精密度稱為重復(fù)性;在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室,不同時(shí)間由不同分析人員用不同設(shè)備測定結(jié)果之間的精密度,稱為中間精密度;在不同實(shí)驗(yàn)室由不同分析人員測定結(jié)果之間的精密度,稱為重現(xiàn)性。
⒉準(zhǔn)確度:指測定值(平均值)與真實(shí)值的接近程度,該指標(biāo)主要是通過回收率來反映。
3.回收率:在空白樣本中添加一定量待測標(biāo)準(zhǔn)樣品,制成已知含量的樣本,然后按擬定的方法對樣本進(jìn)行提取、凈化和測定。所得到的實(shí)測值與已知值比較,實(shí)測值與已知值的百分率即為該方法的回收率。
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2數(shù)據(jù)預(yù)處理
對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰解卷積,積分,峰對齊,標(biāo)準(zhǔn)化處理。通過原始總離子流(TIC)色譜圖,初步觀察儀器的保留時(shí)間重現(xiàn)性,所測得物質(zhì)的情況。
2.3 定量結(jié)果
通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中短鏈脂肪酸的定量結(jié)果,并結(jié)合學(xué)氏T檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)組間差異表達(dá)的化合物。1514339817823940.png
表4. 短鏈脂肪酸定量分析結(jié)果
2.4 PCA分析
對樣本進(jìn)行主成分分析能從總體上反應(yīng)各組樣本之間的總體代謝差異和組內(nèi)樣本之間的變異度大小。使用SIMCA軟件(V14.1, Umetrics, Umea, Sweden),對數(shù)據(jù)進(jìn)行UV格式化(Unit Variance Scaling)和平均中心化(Mean-Centered)處理,然后進(jìn)行自動建模分析,以獲得更加可靠且更加直觀的結(jié)果。