YAC克隆的分析實驗

【資料簡介】

基本方案
實驗材料    酵母菌
試劑、試劑盒    AHCYPD甘油
儀器、耗材    培養(yǎng)箱冷凍管
實驗步驟    
1.  用接種棒將含重組載體pYAC的AB1380菌株劃線接種在AHC平板上，倒扣平板于30℃培養(yǎng)，直至長出1~3 mm 大小的紅色菌落為止。

2.  短期保存：用Parafilm膜將平板周圍封起來，于4℃可保存4~6周。

3.  *保存：接種一個單獨的YAC克隆的菌落于3.2ml YPD培養(yǎng)基中，在30℃搖床，然后加入1 ml 80%甘油，混勻，再分成0.2~1.0  ml 小份將甘油/菌懸液移至冷凍管中，-80℃保存。

制備YAC DNA進行Southern印跡分析

實驗材料    酵母菌
試劑、試劑盒    AHCSCESCEMTris·ClEDTATE乙酸甲RNase A異丙醇NaCl
儀器、耗材    培養(yǎng)箱離心管轉(zhuǎn)子
實驗步驟    
1.  接種一個紅色的含YAC克隆的酵母菌落于盛有20 ml AHC培養(yǎng)基的250 ml 三角燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)搖床上30℃ 250 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h。
 
2.  擴大培養(yǎng)：取1ml 由步驟1獲得的粉紅色菌懸液接種于盛有100 ml AHC培養(yǎng)基的 1 000 ml三角燒瓶中，于30℃ 250 r/min搖床培養(yǎng)24 h。

3.  將菌懸液移入2個50 ml 的錐形離心管中，于2 000 g 離心5 min，棄上清，共用5 ml SCE緩沖液重懸菌體，并合并到一個試管中。

4.  加1 ml SCEM緩沖液，在旋轉(zhuǎn)搖床中37℃ 100 r/min 輕搖晃混勻。

5.  于4℃ 2 000 g 離心棄上清，菌體用5 ml Tris/EDTA裂解液重懸。

6.  加0.5 ml 10%SDS顛倒混合數(shù)次，于65℃溫育20 min。
 
7.  加2 ml 冰浴的5 mol/l pH4.8的乙酸甲緩沖液，顛倒混合數(shù)次后置于冰浴60 min。

8.  于室溫2 000 g 離心10 min，小心將含核酸的上清轉(zhuǎn)移到一個新管中。加室溫2倍體積的95%乙醇，顛倒混勻。

9.  于室溫2 000 g 離心5 min，棄上清，在室溫晾干10~15 min，分別加入3 ml TE緩沖液，pH8.0于37℃溶解核酸。

10.  加入0.1 ml 的1 mg/ml 無DNA酶活性的RNase A，于37℃溫育1 h。
 
11.  加入6 ml 室溫的異丙醇，振蕩并顛倒混勻后用一支毛細管纏繞起染色體，然后溶于0.5 ml TE緩沖液中。

12.  加入50 μl 5 mol/l NaCl和2 ml 95%乙醇，顛倒混勻。

13.  再一次纏繞起染色體DNA，并溶于0.5 ml TE緩沖液中，于4℃保存?zhèn)溆谩?br> 
14.  取毎小份2 μg 的YAC DNA和15 μg 用以構(gòu)建YAC文庫的某物種或個體的基因組DNA。

15.  采用幾種高頻切割的限制性內(nèi)切酶進行酶切，接著用單拷貝探針進行雜交和核酸印跡分析。
 
16.   一旦通過核酸印跡實驗確證YAC克隆，那么可通過制備染色體凝膠校塊塞和進行脈沖電場凝膠電泳，來明確重組YAC的大小并對其穩(wěn)定性進行初步評價。