乙醇脫氫酶（ADH）活性測(cè)定試劑盒

【資料簡(jiǎn)介】

測(cè)定意義：

ADH是生物體內(nèi)短鏈醇代謝的關(guān)鍵酶，催化乙醇與乙醛可逆轉(zhuǎn)換，在很多生理過(guò)程中起著重要作用。哺乳動(dòng)物ADH主要在肝臟生成，肝臟損傷導(dǎo)致ADH釋放到血清中。血清ADH活性高低反映了肝功能是否異常。

測(cè)定原理：

ADH催化NADH還原乙醛生成乙醇和NAD⁺，NADH在340nm處有吸收峰，而NAD⁺沒(méi)有；測(cè)定340nm 吸光度下降速率，來(lái)計(jì)算ADH活性。

自備儀器和用品：

研缽、冰、低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液器和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1瓶，室溫保存。

試劑二：液體×1瓶，4℃保存。臨用前把試劑三轉(zhuǎn)移到試劑二中，4℃保存。                 

試劑三：粉劑×1瓶，－20℃保存。

試劑四：液體×1支，4℃保存。

粗酶液提取：

1、稱取約0.1g樣品，加試劑一1ml，冰上充分研磨，16000g 4℃離心20min，取上清待測(cè)。2、血清可以直接用于測(cè)定。

ADH測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到340 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二在25℃水浴中保溫30 min以上。

3. 空白管：在微量石英比色皿/96孔板中依次加入20μL蒸餾水、160μL試劑二和20μL試劑四，迅速混勻后于340nm測(cè)定吸光值變化，分別記錄15s和75s時(shí)吸光值，分別記為A1和A2。△A空白管=A1-A2。空白管只需做1~2個(gè)。

4. 測(cè)定管：在微量石英比色皿/96孔板中依次加入20μL上清液、160μL試劑二和20μL試劑四，迅速混勻后于340nm測(cè)定吸光值變化，分別記錄15s和75s時(shí)吸光值，分別記為A3和A4。△A測(cè)定管=A3-A4。

ADH活性計(jì)算：

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1μmol NADH 為1U。

ADH (U/mg prot) =[(△A測(cè)定管–△A空白管)÷(ε×d)×V反總×10⁶] ÷(Cpr×V樣)÷T

=1.61×(△A測(cè)定管–△A空白管) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

活性單位定義：25℃中每克樣品每分鐘氧化1μmol NADH 為1U。

ADH (U/g 鮮重) =[(△A測(cè)定管–△A空白管)÷(ε×d)×V反總×10⁶] ÷(V樣÷V樣總×W)÷T

=1.61×(△A測(cè)定管–△A空白管) ÷W

ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min。

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1μmol NADH 為1U。

ADH (U/mg prot) =[(△A測(cè)定管–△A空白管)÷(ε×d)×V反總×10⁶] ÷(Cpr×V樣)÷T

=3.22×(△A測(cè)定管–△A空白管) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

活性單位定義：25℃中每克樣品每分鐘氧化1μmol NADH 為1U。

ADH (U/g 鮮重) =[(△A測(cè)定管–△A空白管)÷(ε×d)×V反總×10⁶] ÷(V樣÷V樣總×W)÷T

=3.22×(△A測(cè)定管–△A空白管) ÷W

ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min。

注意事項(xiàng)：

上清液蛋白質(zhì)濃度需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。