細胞實驗技術(shù)匯總-細胞組分的化學反應(yīng)
【實驗?zāi)康摹?/span>

了解核酸、蛋白質(zhì)、糖及酶的細胞化學反應(yīng)原理，掌握 Brachet 反應(yīng)及堿性蛋白、酸

性蛋白、糖原和過氧化物酶的細胞化學染色方法。

【實驗用品】

一、材料和標本 蟾蜍、小白鼠各一只、肝臟石臘切片、培養(yǎng)的 Hela 細胞。

二、器材和儀器 光學顯微鏡、解剖器材、蠟盤、載玻片、吸水紙、染色缸、蓋玻片、

水浴箱。

三、試劑 PBS 緩沖液（pH7.2）、甲基綠一呱咯寧醋酸緩沖液、純丙酮、l/2 丙酮+1/2 二

甲苯、純二甲苯、70％乙醇、5％三氯醋酸、0.1％堿性固綠、0.1％酸性固綠、0.5％硫酸

銅、聯(lián) 苯胺混合液、1 ％番紅、無 水乙醇、過 碘酸酒精液、S chiff 氏酒精液、亞 硫酸水、E hrlieh

蘇木精、95％乙醇、Carnoy 固定液（甲醇：冰醋酸=3:1，體積比）

【實驗內(nèi)容】

細胞的組織化學方法，是研究細胞成分常用的方法之一。它是利用化學試劑與細胞內(nèi)

的某些物質(zhì)進行化學反應(yīng)，從而在細胞局部形成有色沉淀物，再通過顯微鏡對組織內(nèi)的生

物化學成分進行定性、定位、定量研究。

一、Brachet 反應(yīng)一顯示細胞內(nèi)的 DNA 和 RNA

（一）原理

細胞經(jīng)甲基綠一呱咯寧混合液處理后，其中的 DNA 和 RNA 出現(xiàn)不同的呈色反應(yīng)，一般

認為這是由于帶有負電荷的核酸對堿性染料呱咯寧和甲基綠具有親和力，且這兩種染料的

作用有選擇性，甲基綠染高聚分子的 DNA 呈藍綠色，呱咯寧染低聚分子的 RNA 呈紅色。由

此對細胞中的 DNA 和 RNA 進行定位、定性、和定量分析。

（二）方法

l．接種 Hela 細胞于蓋片上并培養(yǎng) 24～48 小時，使長成單層。

2．取出蓋片，用 PBS（pH7.2）輕輕沖洗蓋片表面去除殘渣。

3．放入 Carnoy 固定液中固定 l 小時。

4．浸入甲基綠一呱咯寧醋酸緩沖液中 30 分鐘染色。

5．取出蓋片放入蒸餾水中輕輕漂洗 2～3 次（2～3 秒鐘左右），吸去水分。放入純丙酮

中分色 2～3 秒鐘。

6. 放入 l／2 丙酮+1／2 二甲苯中 5 秒鐘。

7．放入純二甲苯中透明 5 分鐘。

8．滴一滴中性樹膠于載玻片上，將蓋片標本面朝下封片。

9．鏡下觀察

（三）結(jié)果

細胞質(zhì)被染成淺紅色，細胞核被染成藍綠色，而其中核仁被染成紫紅色（參照照片）。

二、細胞內(nèi)堿性蛋白和酸性蛋白的顯示

（一）原理

由于不同的蛋白質(zhì)分子所帶的堿性和酸性基團的數(shù)目不同，在 pH 值不同的溶液中，蛋

白質(zhì)分子所帶的凈電荷多少不同。如在生理條件下，整個蛋白質(zhì)所帶負電荷多，則為酸性

蛋白質(zhì)；帶正電荷多，則為堿性蛋白質(zhì)。據(jù)此，可將標本經(jīng)三氯醋酸處理提出核酸后，用

不同 pH 值的固綠染液分別染色，細胞內(nèi)的酸性蛋白和堿性蛋白質(zhì)顯示出來。

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（二）方法

1．以破壞脊髓法處死蟾蜍，將其腹面向上放人蠟盤中，剪開胸腔，打開心包。小心將

心臟剪一小口，取心臟血一滴滴在干凈載玻片一端，推片，按此法制備二張血涂片，室溫

晾干。

2. 將涂片作好標記放在 70％乙醇中固定 5 分鐘，室溫晾干。

3．放入 5％三氯醋酸中 60℃30 分鐘，抽提出核酸。

4．清水沖洗多次（3 分鐘以上），以沖去痕跡的三氯醋酸。

5．濾紙吸干玻片上水分。

6. 一張片放入 0.1％堿性固綠（pH8.0～8.5）中染色 10～15 分鐘,另一張片放入 0.1％

酸性固綠（pH2.0～2.5）染色 5～10 分鐘。

7．清水沖洗，蓋上蓋片鏡檢。

（三）結(jié)果

經(jīng)堿性固綠染色片中，胞質(zhì)、核仁不著色，細胞核大部分被染成綠色，是為堿性蛋白

質(zhì)存在處（參照照片）。經(jīng)酸性固綠染色片中，因胞質(zhì)和核仁中有酸性蛋白，被染成綠色。

三、細胞內(nèi)過氧化物酶的顯示

（一）原理

過氧化物酶能把許多胺類氧化為有色化合物，用聯(lián)苯胺處理標本，細胞內(nèi)的過氧化物

酶能把聯(lián)苯胺氧化為藍色的聯(lián)苯胺藍，進而變?yōu)樽厣a(chǎn)物，因而可以根據(jù)顏色反應(yīng)來判定

過氧化物酶的有無或多少。

（二）方法

1．取小鼠一只，以頸椎脫位法將其處死，迅速剖開其后肢暴露出股骨，將股骨一端斜

向剪斷，用 PBS 緩沖液濕潤過的注射器針頭吸出骨髓一滴滴到載玻片上。

2．推片，室溫晾干。

3．將涂片放入 0.5％硫酸銅中浸 30 秒~1 分鐘。

4．取出涂片直接放入聯(lián)苯胺混合液中反應(yīng) 6 分鐘。

5．清水沖洗，放入 1％番紅溶液中復染 2 分鐘。

6．清水沖洗，室溫晾干。

7．鏡檢或封片后鏡檢。

（三）結(jié)果

涂片中可見一些細胞中存在著藍色或棕色顆粒，為過氧化物酶所在位置。

四、過碘酸雪夫反應(yīng)（PAS）——顯示細胞內(nèi)糖原（參照照片和示教片）

（一）原理

組織、細胞的多糖、粘多糖及粘蛋白等都可用 PAS 法來顯示，其化學基礎(chǔ)是利用過碘

酸的氧化作用，打開碳鏈形成醛，生成的醛基與 Schiff 試劑中的無色品紅反應(yīng)形成紫紅色

化合物。

（二）方法

l．取 l~2mm 厚的肝組織塊，用 Carnoy 氏液 4℃固定 4～6 小時。

2．乙醇脫水、二甲苯透明。石蠟包埋，切片。

3．用 70％乙醇展片。

4．脫蠟：二甲苯（1）5 分鐘→二甲苯（2）5 分鐘→100％乙醇 5 分鐘→含 1％火棉膠的乙

醇液 1 分鐘→70％乙醇 1 分鐘。

5．直接浸入過碘酸酒精液反應(yīng) 5～15 分鐘，經(jīng) 70％乙醇洗片刻。

6．浸入 Schiff 氏酒精液反應(yīng) 15 分鐘。

7．亞硫酸水洗三次，以洗去多余的非特異性結(jié)合的色素，以及擴散的染料。

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8．流水沖洗 3～5 分鐘。

9．蒸餾水洗。

10．浸入 Ehrlich 蘇木精復染 20~30 秒，使細胞核著色。

11．脫水：95％乙醇 3 分鐘二次→100％乙醇 3 分鐘二次→二甲苯透明 10 分鐘二次。

12．加蓋片鏡檢或樹膠封固后鏡檢。

（三）結(jié)果

細胞中呈紫紅的顆粒即為糖原（參照照片）。

五、蘇丹Ⅲ染色——顯示細胞內(nèi)脂肪（示教片）