堿變性法提取質(zhì)粒dna
　　
　　質(zhì)粒(Plasmid)是細菌染色體外能自身獨立復(fù)制的雙股環(huán)狀DNA。帶有遺傳信息，可賦予細菌某些新的表型。將質(zhì)粒指紋圖譜分析方法、質(zhì)粒DNA探針技術(shù)及檢測質(zhì)粒的PCR技術(shù)用于臨床感染性疾病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查已成為現(xiàn)實。質(zhì)粒作為載體在基因工程中起著重要的作用。
　　
　　分離和純化質(zhì)粒DNA的方法很多,但這些方法基本包括三個步驟：即細菌的培養(yǎng)和質(zhì)粒DNA的擴增，細菌菌體的裂解;質(zhì)粒dna的提取與純化。
　　
　　本實驗學(xué)習(xí)用堿變性方法提取質(zhì)粒DNA。
　　
　　【原理】
　　
　　細菌培養(yǎng)物加入SDS和NaOH堿性溶液處理后，菌體裂解，可使細菌的質(zhì)粒DNA、染色體DNA和RNA一起從細胞內(nèi)釋放出來，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，因各種核酸分子的遷移率不同將上述核酸分成不同的帶。用溴化乙錠(EB)染色后，在紫外線燈下可看到各種核酸帶發(fā)出的熒光。根據(jù)熒光的位置，可區(qū)分不同的核酸帶。
　　
　　【材料】
　　
　　1.菌株E.coliJM109(pUC19)，E.coliRRI(pBR322)
　　
　　2.試劑溶液Ⅰ(50mM葡萄糖,25mMTris.HclPH8.0,10mMEDTA)
　　
　　溶液II(0.2NNaOH，1%SDS)用前新配制
　　
　　溶液III(5mMKAc溶液PH4.8)
　　
　　TE緩沖液(10mMTris.Hcl,1mMEDTAPH8.0)
　　
　　LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g,，酵母粉5g,Nacl10g.加蒸餾水溶解，用NaOH調(diào)PH至7.5，加水至1000ml,15磅高壓滅菌15分鐘)。
　　
　　【方法】
　　
　　1.接種細菌于5mlLB液體培養(yǎng)基中，370C培養(yǎng)過夜。
　　
　　2.3000rpm/min,離心15min，棄上清。加入100ul溶液1懸起細菌沉淀。
　　
　　3.加入200ul前新配制的溶液II，顛倒EP管5次混合均勻，置冰浴2min。
　　
　　4.加入150ul溶液III溫和地混勻，12000rpm/min,離心5min。
　　
　　5.吸取上清清亮裂解液放入另一新EP管中，加等體積酚-氯仿-異戊醇抽提2次，12000rpm/min,離心2min。(若不做酶切，此步可省略)吸取上清放入另一新EP管中，加入二倍體積的冷乙醇，12000rpm/min,離心10min。
　　
　　6.棄乙醇，干燥后用30ulTE緩沖液洗下核酸，待電泳檢測。
　　
　　(二)瓊脂糖凝膠電泳
　　
　　瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)(Agarosegelelectroghoresis)是分離、鑒定和提純DNA片斷的有效方法。凝膠分辨率決定于使用材料的濃度，并由此決定凝膠的孔徑。瓊脂糖凝膠可分辯0.1~6.0kb的雙鏈DNA片段。瓊脂糖凝膠電泳是一個電場作用。它首先利用瓊脂糖的分子篩效應(yīng)，此外，在弱堿性條件下，DNA分子帶負(fù)電荷，從負(fù)極向正極移動。根據(jù)DNA分子大小、結(jié)構(gòu)及所帶電荷的不同，它們以不同的速率通過介質(zhì)運動而相互分離。借助溴化乙錠(EB)能與雙鏈DNA結(jié)合的作用，利用EB染色，并通過紫外線激發(fā)即可觀察被分離DNA片段的位置。
　　
　　【材料】
　　
　　1.瓊脂糖、10×TAE電泳緩沖液(40mMTris,20mMNaAc,1mMEDTAPH8.0)
　　
　　2.載體緩沖液(0.25%溴酚藍，30%甘油)、溴化乙錠水溶液(10mg/ml)
　　
　　3.凝膠槽、電泳儀
　　
　　【方法】
　　
　　1.取瓊脂糖0.9g，加入100ml1xTAE電泳緩沖液于250ml燒瓶中，1000C加熱溶解。
　　
　　2.平衡凝膠槽，放好兩側(cè)擋板，調(diào)節(jié)好梳子與底板的距離(一般高出底板0.5~1mm)。
　　
　　3.鋪板：在溶解好的凝膠中加入終濃度為0.5ug/ml的溴化乙錠水溶液，輕輕混勻，待冷至500C左右倒入凝膠槽，膠厚一般為5~8mm。
　　
　　4.待膠*凝固后，去掉兩側(cè)擋板，將凝膠放入盛有電泳液的槽中(加樣孔朝向負(fù)，DNA由負(fù)極向正極移動)，使液面高出凝膠2~3mm，小心拔出梳子。
　　
　　5.DNA樣品與載體緩沖液5：1混合并加入凹孔中(樣品不可溢出)。
　　
　　6.打開電源，調(diào)節(jié)所需電壓，電壓與凝膠的長度有關(guān)，一般使用電壓不超過5v/cm。
　　
　　7.據(jù)指示染料移動的位置，確定電泳是否終止(溴酚藍的涌動距離在5sRNA和0.3kbDNA帶之間)。
　　
　　8.電泳完畢關(guān)閉電源。將凝膠放紫外燈下觀察并拍照。