重組克隆的篩選和鑒定是基因工程中的重要環(huán)節(jié)之一。不同的克隆載體和相應(yīng)的宿主系統(tǒng)，其重組克隆的篩選和鑒定方法不盡相同。從理論上說(shuō)，重組克隆的篩選是排除自身環(huán)化的載體、未酶解*的載體以及非目的DNA片斷插入的載體所形成的克隆。常用的篩選方法有兩類(lèi)。一類(lèi)是針對(duì)遺傳表型改變篩選法，以?－半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選法為代表。另一類(lèi)是分析重組子結(jié)構(gòu)特征的篩選法，包括快速裂解菌落鑒定質(zhì)粒大小、限制酶圖譜鑒定、Southern 印跡雜交、PCR、菌落（或噬菌斑）原位雜交等方法。
1．－半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選法（藍(lán)白斑篩選法）
使用本方法的載體包括M13噬菌體、pUC質(zhì)粒系列、pGEM質(zhì)粒系列等。這些載體的共同特征是載體上攜帶一段細(xì)菌的基因lacZ。lacZ編碼?－半乳糖苷酶的一段146個(gè)氨基酸的?肽，載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞為lacZ△M15基因型。重組子由于外源片斷的插入使?肽基因失活不能形成?互補(bǔ)作用，也就是說(shuō)，宿主細(xì)胞表現(xiàn)為?－半乳糖苷酶失活。因此，在X-gal平板上，重組克隆為無(wú)色噬菌斑或菌落，非重組克隆為藍(lán)色噬菌斑或菌落。這種篩選方法操作簡(jiǎn)單，但當(dāng)插入片斷較短（小于500bp），且插入片斷沒(méi)有影響lacZ基因的讀框時(shí)，有假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。
2．快速裂解菌落鑒定質(zhì)粒大小
從平板中挑取菌落，過(guò)夜培養(yǎng)后裂解，直接進(jìn)行凝膠電泳，與載體DNA比較，根據(jù)遷移率的減小初步判斷是否有插入片斷存在。本方法適用于插入片斷較大的重組子的初步篩選。
3．限制酶圖譜鑒定
對(duì)于初步篩選具有重組子的菌落，提純重組質(zhì)?；蛑亟M噬菌體DNA，用相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶（一種或兩種）切割重組子釋放出的插入片斷，對(duì)于可能存在雙向插入的重組子還可用適當(dāng)?shù)南拗菩詢(xún)?nèi)切酶消化鑒定插入方向，然后用凝膠電泳檢測(cè)插入片斷和載體的大小。
4．Southern 印跡雜交
為確定DNA插入片斷的正確性，在限制性?xún)?nèi)切酶消化重組子、凝膠電泳分離后，通過(guò)Southern印跡轉(zhuǎn)移將DNA移至硝酸纖維膜上，再用放射性同位素或非放射性標(biāo)記的相應(yīng)外源DNA片斷作為探針，進(jìn)行分子雜交，鑒定重組子中的插入片斷是否是所需的靶基因片斷。
5．PCR法
用PCR對(duì)重組子進(jìn)行分析，不但可以迅速擴(kuò)增插入片段，而且可以直接進(jìn)行DNA序列分析。因?yàn)閷?duì)于表達(dá)型重組子，其插入片斷的序列的正確性是非常關(guān)鍵的。PCR法既適用于篩選含特異目的基因的重組克隆，也適用于從文庫(kù)中篩選含感興趣的基因或未知的功能基因的重組克隆。前者采用特異目的基因的引物，后者采用載體上的通用引物。
6．菌落（或噬菌斑）原位雜交
菌落或噬菌斑原位雜交技術(shù)是將轉(zhuǎn)化菌DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，用放射性同位素或非放射性標(biāo)記的特異DNA或RNA探針進(jìn)行分子雜交，然后挑選陽(yáng)性克隆。這種方法能進(jìn)行大規(guī)模操作，是篩選基因文庫(kù)的方法。
本實(shí)驗(yàn)采用限制酶圖譜鑒定。
核酸限制性?xún)?nèi)切酶是在原核生物中發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)專(zhuān)一識(shí)別雙鏈DNA中特定堿基序列的核酸水解酶，它們的功能類(lèi)似于高等動(dòng)物的免疫系統(tǒng)，用于抗擊外來(lái)DNA的侵襲?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)幾百種限制性?xún)?nèi)切酶，分子生物學(xué)中經(jīng)常使用的是II型限制性?xún)?nèi)切酶，它能識(shí)別雙鏈DNA分子中特定的靶序列（4～8bp）, 以?xún)?nèi)切方式水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的DNA片段5'端為P，3'端為OH。由于限制性?xún)?nèi)切酶能識(shí)別DNA 特異序列并進(jìn)行切割，因而在基因重組、DNA序列分析、基因組甲基化分析、基因物理圖譜繪制及分子克隆等技術(shù)中收到廣泛應(yīng)用。酶活力通常用酶單位（U）表示，酶單位的定義是：在zui適反應(yīng)條件下，1小時(shí)*降解1μg DNA的酶量為一個(gè)單位。
【試劑與器材】
（一）試劑
1.質(zhì)粒提取試劑（見(jiàn)實(shí)驗(yàn)五）
2.限制性?xún)?nèi)切酶Kpn I 及10×酶切緩沖液。
3.限制性?xún)?nèi)切酶Xbal I及10×酶切緩沖液。
4.TAE電泳緩沖液或TBE電泳緩沖液
5.瓊脂糖（Agarose）
6.6×電泳加樣緩沖液：0.25％ 溴粉藍(lán)，40％(w/v) 蔗糖水溶液，貯存于 4℃。
（二）器材
水平電泳裝置、電泳儀、水浴鍋、恒溫振蕩器、臺(tái)式高速離心機(jī)、微量移液器、凝膠成像系統(tǒng)等。
（三）菌株
大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)化菌。
【操作方法】
1. 質(zhì)粒提取步驟(見(jiàn)實(shí)驗(yàn)五)
2. 酶切反應(yīng)
1)在滅菌的0.5mL EP管中加入重組質(zhì)粒DNA 1μg和相應(yīng)的10×M buffer 2μL（見(jiàn)附錄1），再加入滅菌重蒸水至酶切總體積為20μL，將管內(nèi)溶液混勻后各加入1μLKpn I和Xbal I酶液雙酶切，用手指輕彈管壁使溶液混勻或用微量離心機(jī)甩一下，使溶液集中在管底。如果是同一條件下進(jìn)行多個(gè)酶切反應(yīng)，建議統(tǒng)一加好相同的組分后混勻分裝，zui后加入DNA樣品。
酶切反應(yīng)加樣表：
八 重組克隆篩選（酶切鑒定）
2)混勻反應(yīng)體系后，將EP管置于適當(dāng)?shù)闹С治锷希ㄈ绮逶谂菽芰习迳希?7℃水浴保溫2h-3h，使酶切反應(yīng)*。
3)每管加入2μL 0.1mol/L EDTA (pH8.0)，混勻，以停止反應(yīng)，或置65℃水浴中10min，對(duì)限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行滅活，不同的酶滅活條件可能不同，可參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。滅活后的酶切溶液置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?br />4)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切反應(yīng)的結(jié)果。
【注意事項(xiàng)與提示】
1.影響限制性?xún)?nèi)切酶活性的因素包括：
a)酶切割位點(diǎn)周?chē)塑账醿蓚?cè)的堿基的性質(zhì)；
b)識(shí)別序列在DNA中的分布頻率；
c)與DNA的構(gòu)象有關(guān)（SC,L,OC）；
d)DNA的純度（蛋白、氯仿、SDS、EDTA、甘油等）
因此，酶切時(shí)應(yīng)盡量注意將影響酶切的因素降低到zui小。
2.市售的酶一般濃度很大，為節(jié)約起見(jiàn)，使用時(shí)可事先用酶反應(yīng)緩沖液（1×）進(jìn)行稀釋?zhuān)豢刹扇∵m當(dāng)延長(zhǎng)酶切時(shí)間或增加酶量的方式提高酶切效率，但內(nèi)切酶用量不能超過(guò)總反應(yīng)體積的10%，否則，酶活性將因?yàn)楦视瓦^(guò)量受到影響。
3.由于EDTA的存在會(huì)抑制連接酶的活性，通常采用加熱方法終止酶切反應(yīng)。
4.酶切反應(yīng)的整個(gè)過(guò)程應(yīng)注意槍頭的潔凈以避免造成對(duì)酶的污染，為防止酶活性降低，取酶時(shí)應(yīng)在冰上操作且動(dòng)作迅速。
【實(shí)驗(yàn)安排】
第三天觀察轉(zhuǎn)化結(jié)果（藍(lán)白斑情況），計(jì)算重組率。提取重組質(zhì)粒DNA、酶切鑒定。
【實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求與思考題】
1.提交重組質(zhì)粒酶切瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。
2.提交連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化平板照片并計(jì)算重組率。
陽(yáng)性重組率= [ 白色菌落數(shù)/（白色菌落+藍(lán)色菌落）]×
