（一）雙縮脲測(cè)定法
1．原理 蛋白質(zhì)中的肽鍵有雙縮脲反應(yīng)，在堿性溶液中與二價(jià)銅離子形成藍(lán)紫色的絡(luò)合物，在一定的范圍內(nèi)，顏色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比。此法特異性強(qiáng)，游離的氨基酸、小肽和核酸均不產(chǎn)生這種反應(yīng)，但此法不夠敏感，僅能測(cè)出毫克水平。
2．試劑配制
硫酸銅（CuSO4·5H2O） 1.50g
酒石酸鉀鈉 5.00g
H2O 500.0ml
10%氫氧化鈉（不含硫酸鈉）300ml
H2O 加至 1 000ml
此溶液可保存，如產(chǎn)生暗紅色沉淀，則應(yīng)廢棄重配。
3．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
⑴ 準(zhǔn)確稱取牛血清白蛋白1.0g（必要時(shí)須首先采用凱氏定氮法測(cè)定牛血清白蛋白制品中實(shí)際純蛋白含量，然后換算），以生理鹽水配成1%的濃度。
⑵ 將1%的牛血清白蛋白按表8-1進(jìn)行稀釋：
表8-1 牛血清白蛋白稀釋方法表
成 分 | 試 管 號(hào) |
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 |
1％蛋白液（ml） | 1.0 | .09 | 0.8 | 0.7 | 0.6 | 0.5 | 0.4 | 0.3 | 0.2 | 0.1 | － |
蛋白含量（mg） | 10 | 9 | 8 | 7 | 6 | 5 | 4 | 3 | 2 | 1 | － |
生理鹽水（ml） | 0.5 | 0.6 | 0.7 | 0.8 | 0.9 | 1.0 | 1.1 | 1.2 | 1.3 | 1.4 | 1.5 |
雙縮脲試劑（ml） | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 |
試劑蛋白含量（mg） | 8.0 | 7.2 | 6.4 | 5.6 | 4.8 | 4.0 | 3.2 | 2.4 | 1.6 | 0.8 | 0 |
注：1%牛血清白蛋白，經(jīng)凱氏定氮測(cè)定含純蛋白為80%。
⑶ 混勻后于室溫放置0.5h～1h，光電比色（540nm），順序由低濃度至高濃度，每管測(cè)3次，求其平均值。
⑷ 以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，蛋白含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
4．樣品測(cè)定
⑴ 取樣品0.1ml，加生理鹽水1.4ml。也可將樣品做1﹕10稀釋加1ml，再加生理鹽水0.5ml。
⑵ 加雙縮脲試劑4.0ml，混勻，至室溫0.5h～1h。
⑶ 另以1.5ml生理鹽水加4.0ml雙縮脲試劑作為空白對(duì)照。
⑷ 測(cè)OD540值。
⑸ 根據(jù)OD值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出蛋白含量。
注意：各種雙縮脲試劑的配法、加量及室溫靜置時(shí)間均有差異，一旦標(biāo)準(zhǔn)曲線制定后，樣品的測(cè)定則必須與標(biāo)準(zhǔn)曲線制定的條件一致，否則結(jié)果有差異。
（二）紫外光譜吸收法
1．原理 本法根據(jù)蛋白之中的芳香族氨基酸－、在紫外光區(qū)的吸收特點(diǎn)而建立的。蛋白質(zhì)在280nm波長(zhǎng)附近有一吸收峰，其吸收程度與這些氨基酸的含量成正比。此法靈敏度高，可測(cè)到微克水平，操作簡(jiǎn)單，不需要加各種試劑，測(cè)完后，樣品可回收。
2．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
⑴ 用精密天平稱取牛血清白蛋白50mg，溶于50ml生理鹽水中。
⑵ 以生理鹽水再稀釋成每ml含0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg……0.9mg，以鹽水對(duì)照。
⑶ 測(cè)各管OD280值。
⑷ 以O(shè)D280值為縱坐標(biāo)，蛋白含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3．樣品測(cè)定
將待測(cè)樣品以鹽水適當(dāng)稀釋，在0.10mg/ml~1.00mg/ml之間，以生理鹽水為對(duì)照，測(cè)OD280值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出蛋白含量。
（三）Folin酚法
1．原理 蛋白質(zhì)中的與和Folin酚試劑中的磷鎢酸、磷鉬酸作用后，在堿性條件下不穩(wěn)定，被還原成藍(lán)色的化合物（鉬藍(lán)）。因此通過比色即可測(cè)知標(biāo)本中的蛋白含量。該法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，且不受溶液中脂多糖的干擾。
2．試劑
試劑甲：
A液：Na2CO3 10.00g
NaOH 2.00g
酒石酸鉀鈉（或鉀鹽鈉鹽）0.25g
混合、溶于500ml蒸餾水中。
B液：CuSO4·5H2O 0.5g
H2O 100.00ml
用前將A液50份與B液1份混合即為試劑甲。
試劑乙：
于磨口回流瓶加入下列試劑
Na2WO4·2H2O 100.00g
NaMoO4·2H2O 25.00g
H2O 700.00ml
85%H3PO4 50.00ml
濃HCl 100.00ml
按上回流冷凝管以小火回流10h后再加：
硫酸鋰 150.00g
H2O 50.00ml
溴水 數(shù)滴
開口繼續(xù)沸騰15min，驅(qū)除過量的溴，冷卻后溶液呈黃色微帶綠色（如仍呈綠色，須重復(fù)滴加液體溴步驟）。稀釋至1L，過濾，濾液置于棕色瓶保存。使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)NaOH液滴定，以為指示劑，然后適當(dāng)稀釋（加水約1倍）使zui終濃度為1mol/L。
3．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
⑴ 取標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白2.50mg，溶于10ml蒸餾水中，使成250μg/ml。
⑵ 按表8-2稀釋。
表8-2 標(biāo)準(zhǔn)曲線稀釋方法
成分 | 試 管 號(hào) |
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 |
牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（ml） | 0 | 0.2 | 0.2 | 0.4 | 0.1 | 0.6 | 0.6 | 0.8 | 0.8 | 1.0 | 1.0 |
生理鹽水（ml） | 1.0 | 0.8 | 0.8 | 0.6 | 0.6 | 0.4 | 0.4 | 0.2 | 0.2 | 0 | 0 |
蛋白含量(μg／ml) | 0 | 50 | 50 | 100 | 100 | 150 | 150 | 200 | 200 | 250 | 250 |
⑶ 每管加試劑甲5ml，混合后室溫放置10min，再加0.50ml試劑乙（即Folin酚試劑），立即搖勻（否則顯色降低）。
⑷ 30min后測(cè)OD650nm。
⑸ 以O(shè)D為縱坐標(biāo)，蛋白含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
4．樣品測(cè)定
⑴ 待測(cè)樣品1ml（適當(dāng)稀釋至約含25μg－250μg/ml）。
⑵ 加試劑甲、乙。
⑶ 比色、測(cè)OD650值。
⑷ 查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求蛋白含量乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的蛋白含量。
（四）紫外分光測(cè)定法
A1%1cm＝13.8（IgG）(280nm)
A1%1cm＝14.5(IgM)(280nm)
蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）=1.45OD280－0.74OD260 （此為經(jīng)驗(yàn)公式，即以不同濃度的蛋白質(zhì)和核酸混
