A.siRNA轉(zhuǎn)染的方法
哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)染的常見(jiàn)方法有：磷酸鈣共沉淀、電穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene、機(jī)械法（例如,顯微注射和基因槍?zhuān)㈥?yáng)離子脂質(zhì)體試劑，其中陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑轉(zhuǎn)染法是目前zui常用的轉(zhuǎn)染方法。
應(yīng)用脂質(zhì)體型轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染需要注重的幾個(gè)方面：
1. 轉(zhuǎn)染試劑的用量
2. siRNA的用量
3. 轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度
4. 轉(zhuǎn)染時(shí)的操作順序
5. 細(xì)胞與轉(zhuǎn)染試劑/siRNA復(fù)合物的溫浴的時(shí)間
B. SiMi Transfection Reagents 轉(zhuǎn)染試劑
選擇的轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染條件，往往取決于不同的哺乳動(dòng)物細(xì)胞類(lèi)型和不同的核酸分子。SiMi Transfection Reagents適用于核酸的體內(nèi)和體外操作，可應(yīng)用于DNA、RNA、反義寡核苷酸、siRNA的轉(zhuǎn)染，也可應(yīng)用于DNA/siRNA的共轉(zhuǎn)染操作;是一種新型的siRNA轉(zhuǎn)染試劑。
SiMi Transfection Reagents的應(yīng)用領(lǐng)域：
1. 原代培養(yǎng)細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞株的基因轉(zhuǎn)染
2. siRNA高通量轉(zhuǎn)染試驗(yàn)
3. DNA轉(zhuǎn)染;DNA和siRNA的共轉(zhuǎn)染
4. 核酸（siRNA、DNA、RNA）的體內(nèi)導(dǎo)入試驗(yàn)
5. 貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染
SiMi Transfection Reagents 的特點(diǎn)：
1. 不必更換培養(yǎng)基，操作簡(jiǎn)便易行，可在半小時(shí)內(nèi)完成操作
2. 在含血清培養(yǎng)基中也能表現(xiàn)高轉(zhuǎn)染效率
3. 細(xì)胞毒性低;適用細(xì)胞廣泛
4. 即用型試劑，可在含有抗生素的*培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染
5. 基于脂質(zhì)的轉(zhuǎn)染試劑，確保沒(méi)有RNAse活性
6. 可介導(dǎo)siRNA高轉(zhuǎn)染細(xì)胞及體內(nèi)siRNA的導(dǎo)入
C.SiMi Transfection Reagents適用的細(xì)胞類(lèi)型
SiMi Transfection Reagents轉(zhuǎn)染試劑可廣泛應(yīng)用于多種細(xì)胞系的DNA和siRNA轉(zhuǎn)染如：HeLa（人頸部癌細(xì)胞）、MCF-7（人乳房癌細(xì)胞）、Hep3B（人肝細(xì)胞癌細(xì)胞）、COS-7（猴腎細(xì)胞）、Neuro-2a（鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞）、NIKS（人角質(zhì)化細(xì)胞）、B16（鼠黑素瘤細(xì)胞）、DLD-1（人結(jié)腸癌細(xì)胞）、NIH/3T3（鼠胚胎成纖維細(xì)胞）、HT-29（人結(jié)腸腺癌細(xì)胞）、A549（人肺癌細(xì)胞）、CHO-k1（倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞）和293（腺病毒5 DNA轉(zhuǎn)化的人胚胎腎細(xì)胞）,SVRbag4細(xì)胞等。
D.轉(zhuǎn)染前細(xì)胞培養(yǎng)
在細(xì)胞板上培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，應(yīng)使細(xì)胞匯合在24小時(shí)內(nèi)達(dá)到70-90%。
| 細(xì)胞培養(yǎng)用品 | 表面積（mm2/孔） | 細(xì)胞密度 | 培養(yǎng)基（μL /孔） |
| 96孔板 | 50 | 1.5´104-5.0´104 | 100μL |
| 48孔板 | 100 | 3.0´104-1.0´105 | 200μL |
| 24孔板 | 200 | 8.0´104-2.0´105 | 500μL |
| 12孔板 | 401 | 1.6´105-4.0´105 | 1.0 mL |
| 6孔板 | 962 | 3.0´105-8.0´105 | 2.0 mL |
| 35 mm | 962 | 3.0´105-8.0´105 | 2.0 mL |
| 60 mm | 2827 | 1.0´106-2.5´106 | 6.0 mL |
E. 合適的SiMi Transfection Reagents用量
合適的siRNA（DNA）：lipofetamin2000比例對(duì)核酸的轉(zhuǎn)染有重要影響;我們的DNA：lipofetamin2000為1：0.5—1：5（ug:ul），siRNA：SiMi Transfection Reagents為1：0.01-1：0.1（pmol：ul）一般情況下，此范圍內(nèi)都可獲得高的轉(zhuǎn)染效率。
| 細(xì)胞培養(yǎng)用品 | siRNA/DNA | 培養(yǎng)基zui終體積 | SiMi Transfection Reagents（siRNA/DNA） |
| 96孔板 | 5pmol/0.2μg | 100μL | 0.25μl/0.5μl |
| 24孔板 | 20pmol/0.8μg | 500μL | 1μl /2μl |
| 12孔板 | 40 pmol /1.6μg | 1 mL | 2μl /4μl |
| 6孔板 | 100 pmol /4.0μg | 2 mL | 5μl /10μl |
| 35 mm | 100 pmol /4.0μg | 2 mL | 5μl /10μl |
| 60 mm | 600 pmol /8.0μg | 5 mL | 10μl /20μl |
F.貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染程序
選用生理狀態(tài)良好的細(xì)胞對(duì)提高轉(zhuǎn)染效率很重要。siRNA（DNA）和SiMi Transfection Reagents的用量和兩者的比例可在范圍內(nèi)適當(dāng)調(diào)整。
1. 轉(zhuǎn)染前一天，4-5?104細(xì)胞接種在24孔板上， 0.5mL含F(xiàn)BS和抗生素的DMEM（或Opti-MEM，其他培養(yǎng)基）細(xì)胞培養(yǎng)基。
2. 選擇用于初期接種的細(xì)胞數(shù)量，應(yīng)能在24小時(shí)內(nèi)使細(xì)胞匯合達(dá)到70-90%。
3. 在50μl的DMEM（或Opti-MEM，或其他無(wú)血清培養(yǎng)基）無(wú)血清培養(yǎng)基加入20pmol siRNA（或0.8μg DNA），柔和混勻;
4. 混勻SiMi Transfection Reagents試劑，用50μl無(wú)血清的DMEM或Opti-MEM，或其他無(wú)血清培養(yǎng)基）稀釋1μl SiMi Transfection Reagents試劑（DNA轉(zhuǎn)染時(shí)，則加入2μlSiMi Transfection Reagents試劑），輕輕混勻，室溫放置5分鐘;
5. 將稀釋好的siRNA和SiMi Transfection Reagents試劑混合;輕柔混勻，室溫放置20分鐘,以便形成siRNA/SiMi Transfection Reagents（或DNA/SiMi Transfection Reagents）復(fù)合物。
6. 將100μl siRNA/SiMi Transfection Reagents（或DNA/SiMi Transfection Reagents）復(fù)合物加到含有細(xì)胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)板的孔中，來(lái)回輕柔搖晃細(xì)胞培養(yǎng)板板。
7. 細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中37℃溫育24h-48h后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的其它檢測(cè)步驟。如果細(xì)胞株比較敏感，孵育4-6小時(shí)后，除去復(fù)合物，更換培養(yǎng)基。
G.懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染程序
1. 轉(zhuǎn)染的當(dāng)天，收集細(xì)胞離心，用含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基重懸。
2. 在50μl的DMEM（或Opti-MEM，或其他無(wú)血清培養(yǎng)基）無(wú)血清的培養(yǎng)基加入20pmol siRNA（或0.8μg DNA），柔和混勻;
3. 混勻SiMi Transfection Reagents試劑，用50μl無(wú)血清的DMEM或Opti-MEM，或其他無(wú)血清培養(yǎng)基）稀釋1μl SiMi Transfection Reagents試劑（DNA轉(zhuǎn)染時(shí)，則加入2μl SiMi Transfection Reagents試劑），輕輕混勻，室溫放置5分鐘;
4. 將稀釋好的siRNA和SiMi Transfection Reagents試劑混合;輕柔混勻，室溫放置20分鐘,以便形成siRNA/SiMi Transfection Reagents（或DNA/SiMi Transfection Reagents）復(fù)合物。
5. 再加入400μL細(xì)胞懸浮液（細(xì)胞數(shù)量決定于細(xì)胞類(lèi)型和轉(zhuǎn)染后分析測(cè)試的時(shí)間）。
6. 細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中37℃溫育24h-48h后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的其它檢測(cè)步驟。如果細(xì)胞株比較敏感，孵育4-6小時(shí)后，除去復(fù)合物，更換培養(yǎng)基。
<, FONT, face="Tahoma">H.DNA和siRNA共轉(zhuǎn)染細(xì)胞程序
1. 在轉(zhuǎn)染的前一天，4-5?104細(xì)胞接種在24孔板上，0.5 mL含F(xiàn)BS和抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基。
2. 選擇用于初期接種的細(xì)胞密度，應(yīng)能在24小時(shí)內(nèi)使細(xì)胞匯合達(dá)到70-90%。
3. 在100μL的無(wú)血清的培養(yǎng)基中稀釋20pmol siRNA和0.2μg DNA，加入2μl SiMi Transfection Reagents試劑，充分混合，放置20分鐘,以便形成siRNA/ DNA/SiMi Transfection Reagents復(fù)合物。
4. 將siRNA/ DNA/SiMi Transfection Reagents復(fù)合物加入培養(yǎng)基中，輕輕混勻。
5. 細(xì)胞在37℃溫育24h-48h后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的其它步驟。
I.siRNA體內(nèi)導(dǎo)入方法
1. 適量的siRNA或DNA溶于不含RNA酶的無(wú)菌水中，輕輕混勻，因?yàn)樽⑸湟后w積有限，建議采用高濃度的siRNA或DNA，一般DNA為2μg /μL、siRNA為10μg /μL。
2. 取適量的DNA、siRNA或siRNA\DNA復(fù)合物與SiMi Transfection Reagents混合。例如，在1#管中加入0.5μL的DNA（1μg）和0.5μL的siRNA（5μg），在2#管中加入0.55μL的SiMi Transfection Reagents（24μg）和0.45μL不含RNA酶的無(wú)菌水中，將1#管中的溶液加入2#管中，在室溫下溫育30分鐘，以形成siRNA/DNA-SiMi Transfection Reagents復(fù)合物。
3. 制備的siRNA/DNA-SiMi Transfection Reagentse復(fù)合物可用于體內(nèi)導(dǎo)入siRNA、DNA或siRNA\DNA。
