作為的CRISPR 系統(tǒng)，I型CRISPR-Cas的特征是有序的靶標搜索和降解。首先，多亞基監(jiān)測復合物Cascade（用于抗病毒防御的CRISPR相關復合物）識別相匹配的兩側具有的前間區(qū)序列鄰近基序（protospacer-adjacent motif, PAM）的雙鏈DNA靶標，促進CRISPR RNA（crRNA）和靶DNA鏈之間形成異源雙鏈體，并將非靶DNA鏈置換掉，從而導致在靶位點上形成R-環(huán)（R-loop）。隨后，將具有解螺旋酶活性和核酸酶活性的酶Cas3特異性地招募到Cascade/R-loop上并切割和漸進性地降解靶DNA鏈。來自褐色嗜熱裂孢菌（Thermobifida fusca, Tfu）的I-E型Cascade/R-loop和Cas3/單鏈DNA（ssDNA）復合物的高分辨率結構闡明了PAM識別和R-環(huán)形成機制。然而，Cas3招募、DNA切割和降解機制仍然是難以捉摸的。

這些研究人員解析出TfuCascade/R-loop/Cas3在非靶DNA鏈切割前狀態(tài)下的分辨率為3.7埃的低溫電鏡圖。Cas3的結合不會引起形成R-環(huán)的Cascade復合物發(fā)生進一步構象變化，這提示著Cascade-Cas3相互作用在很大程度上是一種構象捕獲機制而不是一種誘導契合機制。 Cas3-Cascade相互作用*是由Cascade中的Cse1亞基介導的。Cas3對Cascade的識別是由于與Cascade/R-loop在電荷和表面輪廓上是互補的，但與Cascade的種泡狀態(tài)（seed-bubble state）并不是互補的。這是因為在R-環(huán)充分形成之前，Cse1的C-末端結構域處于一種替 代性方向。通過與Cse1的兩個結構域進行廣泛接觸，Cas3能夠檢測Cse1的表面輪廓發(fā)生變化，從而排斥處于這樣的功能狀態(tài)下的Cascade。有條件地將Cas3招募到Cascade上就能夠避免錯誤靶向僅具有部分互補性的DNA。

再者，這些研究人員提供了直接的證據(jù)表明一種底物移交機制對I-E型CRISPR干擾是至關重要的。Cas3的HD核酸酶結構域直接捕獲非靶DNA鏈用于鏈切割，而且這種作用*繞過了它的解旋酶結構域。這種底物捕獲依賴于非靶DNA鏈中存在的柔性凸起，而且這種切割位點偏 好性是由這種招募通路預先確定的。

這些研究人員進一步解析出TfuCascade/R-loop/Cas3在非靶DNA鏈切割后狀態(tài)下的分辨率為4.7埃的結構，這就允許他們鑒定出與這種鏈切割反應相伴隨的結構變化。這種結構揭示出由于增加的柔性，R環(huán)區(qū)域中的完整非靶DNA鏈消失了。一旦腺苷5'-三磷酸（ATP）水解， 與PAM相鄰的一半非靶DNA鏈自發(fā)地重新定位到Cas3中的解旋酶結構域的開口處。因此，在ATP水解時，Cas3的解旋酶結構域讓非靶DNA鏈通過它自身并進一步進入Cas3的HD核酸酶結構域，從而進入一種漸進性DNA降解模式。