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反向PCR(reverse PCR)相關知識

時間:2017/8/22閱讀:1000
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反向PCR(reverse PCR)是用反向的互補引物來擴增兩引物以外的未知序列的片段,而常規(guī)PCR擴增的是已知序列的兩引物之間DNA.實驗時選擇已知序列內(nèi)部沒有切點的限制性內(nèi)切酶對該段DNA進行酶切,然后用連接酶使帶有粘性末端的靶序列環(huán)化連接,再用一對反向的引物進行PCR,其擴增產(chǎn)物將含有兩引物外未知序列,從而對未知序進行分析研究.

反向PCR的目的在于擴增一段已知序列旁側(cè)的DNA,也就是說這一反應體系不是在一對引物之間而是在引物外側(cè)合成DNA。反向PCR可用于研究與已知DNA區(qū)段相連接的未知染色體序列,因此又可稱為染色體緩移或染色體步移。這時選擇的引物雖然與核心DNA區(qū)兩末端序列互補,但兩引物3’端是相互反向的。擴增前先用限制性內(nèi)切酶酶切樣品DNA,然后用dna連接酶連接成一個環(huán)狀DNA分子,通過反向PCR擴增引物的上游片段和下游片段;現(xiàn)已制備了酵母人工染色體(YAC)大的線狀DNA段的雜交探針,這對于轉(zhuǎn)座子插入序列的確定和基因庫染色體上DNA段序列的識別十分重要。

該方法的不足是:需要從許多酶中選擇限制酶,或者說必須選擇一種合適的酶進行酶切才能得到合理大小的dna段。這種選擇不能在非酶切位點切斷靶DNA。大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復序列,而在YACCosmid中的未知功能序列中有時也會有這些序列,這樣,通過反向PCR得到的探針就有可能與多個基因序列雜交。

利用反向PCR可對未知序列擴增后進行分析,探索鄰接已知DNA段的序列,并可將僅知部分序列的全長cDNA進行分子克隆,建立全長的DNA探針。適用于基因游走、轉(zhuǎn)位因子和已知序列DNA旁側(cè)病毒整合位點分析等研究。

反向PCR原理

反向PCR(reverse PCR)相關知識

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