CaCl2感受態(tài)細胞的制備的實驗步驟 
1．前夜接種受體菌（ DH5α或 DH10B），挑取單菌落于lb培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)過夜（約16小時）； 
2．取 1ml過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于100ml LB培養(yǎng)基中，在37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約2.5-3小時（250-300rpm）； 
3．將 0.1M CaCl2溶液置于冰上預(yù)冷； 
以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作 
4．吸取 1.5ml培養(yǎng)好的菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘； 
5．4℃下3000g冷凍離心5分鐘； 
6．棄去上清，加入 100μl預(yù)冷0.1M CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮，在冰放置20分鐘； 
7．4℃下3000g冷凍離心5分鐘； 
8．棄去上清，加入 100μl預(yù)冷0.1M CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸??； 
9．細胞懸浮液可立即用于轉(zhuǎn)化實驗或添加冷凍保護劑（ 15% - 20%甘油）后超低溫冷凍貯存?zhèn)溆茫ǎ?0℃）。 

·電轉(zhuǎn)化法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞的實驗步驟 
1．前夜接種受體菌（ DH5α或 DH10B），挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)過夜； 
2．取 2ml過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于200ml LB培養(yǎng)基中，在37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6（約2.5-3小時）； 
3．將菌液迅速置于冰上。以下步驟務(wù)必在超凈工作臺和冰上操作 
4．吸取 1.5ml培養(yǎng)好的菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘； 
5．4℃下3000g冷凍離心5分鐘； 
6．棄去上清，加入 1500μl冰冷的10%甘油，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸?。?nbsp;
7．4℃下3000g冷凍離心5分鐘 
8．棄去上清，加入 750μl冰冷的10%甘油，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸??； 
9．4℃下3000g冷凍離心5分鐘 
10．加入 20μl冰冷10%的甘油，用移液器輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸?。?nbsp;
11．立即使用或迅速置于 -70℃超低溫保存。 
附注： 
影響感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率的因素及實際操作過程中應(yīng)注意的事項： 
1．細菌的生長狀態(tài)：實驗中應(yīng)密切注視細菌的生長狀態(tài)和密度，盡量使用對數(shù)生的細胞（一般通過檢測OD600來控制。DH5α菌株 OD600為 0.5 時細胞密度是 5 × 107/ml ）； 
2．所有操作均應(yīng)在無菌條件和冰上進行； 
3．經(jīng) CaCl2處理的細胞，在低溫條件下，一定的時間內(nèi)轉(zhuǎn)化率隨時間的推移而增加， 24小時達到zui高，之后轉(zhuǎn)化率再下降（這是由于總的活菌數(shù)隨時間延長而減少造成的）； 
4．化合物及無機離子的影響：在 Ca2+的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他二價金屬離子（如 Mn2+或 Co2+ ）、 DMSO 或還原劑等物質(zhì)處理細菌，可使轉(zhuǎn)化效率大大提高（ 100-1000 倍）； 
5．所使用的器皿必須干凈。跡量的去污劑或其它化學(xué)物質(zhì)的存在可能大大降低細菌的轉(zhuǎn)化效率； 
6．質(zhì)粒的大小及構(gòu)型的影響：用于轉(zhuǎn)化的應(yīng)主要是超螺旋的 DNA ； 
7．一定范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化效率與外源 DNA 的濃度呈正比；