1 顯性標(biāo)記與選擇效率

一部分分子標(biāo)記系統(tǒng)如RAPD、AFLP具有顯性或部分顯性的特點，無法區(qū)分基因是純合還是雜合，不能提供完整的遺傳信息。Haley等（1994）提出相斥相（Repulsion－phase）的RAPD標(biāo)記無論對顯性還是隱性均可地提高選擇效率，他們找到了和菜豆普通花葉病毒抗性基因bc-3連鎖相引標(biāo)記-1，相斥標(biāo)記bc-2，用標(biāo)記-1選擇純合抗病株、雜合體、純合感病株分別占26.3%，72.5%和1.2%，用標(biāo)記-2選擇分別占81.8%，18.2%和0，當(dāng)兩個標(biāo)記同時使用時，即相當(dāng)于一個共顯性標(biāo)記，與標(biāo)記2的選擇效率相同。這種方法解決了MAS中，顯性標(biāo)記不能區(qū)分純合、雜合基因型的缺陷。

2 基因型限制

zui有價值的標(biāo)記是在廣泛的基因背景下都能表表達(dá)，并能檢測出來的標(biāo)記。然而，目的基因與標(biāo)記的連鎖距離因遺傳背景的不同而存在差異。標(biāo)記與目的基因的遺傳距離是影響輔助選擇效率的一個重要因素。菜豆上，來源于Andean的抗性基因的RAPD標(biāo)記在Middle America的遺傳背景下表現(xiàn)緊密連鎖，反之也成立。但在供體遺傳背景下，RAPD標(biāo)記就失去了選擇能力。Andean中OA141100不能用來選擇UP-2基因，OA141100標(biāo)記的應(yīng)用被局限在Middle America內(nèi)。RAPD標(biāo)記連鎖距離的差異,影響了在不同遺傳背景下的選擇效果，尋找無重組的RAPD標(biāo)記或?qū)APD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為RFLP標(biāo)記，可以解決這個問題。

3 標(biāo)記的穩(wěn)定性和可操作性

常用分子標(biāo)記技術(shù)在基因標(biāo)記等方面發(fā)揮了巨大作用，卻存在一些缺點，如RFLP、AFLP等，成本高，操作繁瑣，周期長，又有放射性污染，不適合于大樣本選擇。RAPD雖無上述缺點，但卻存在穩(wěn)定性差的弊端，將它們轉(zhuǎn)化為特異性擴(kuò)增子多態(tài)性（Specific Amplificon Polymorphism，SAP）或稱目標(biāo)性狀位點（Sequence Tagged Sites，STS）可以解決這些缺點。主要包括以下兩種1）酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence，CAP）對RFLP探針的兩端測序，合成22引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物往往無多態(tài)性，需用內(nèi)切酶酶解產(chǎn)物，產(chǎn)生多態(tài)性。2）序列特異性擴(kuò)增區(qū)（Sequence-characterized Amplified Region，SCAR），對RAPD片段兩端測序，根據(jù)所測DNA序列，合成24bp雙引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。SCAR、CAP可以降低成本，操作簡便，穩(wěn)定性強(qiáng)，對儀器要求低，適合于大樣本、快速分析。