序列測定的技術(shù)和策略
Sanger雙脫氧鏈終止法
Maxam－Gilbert DNA化學降解法
測序策略

目前應(yīng)用的兩種快速序列測定技術(shù)是Sanger等（1977）提出的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的化學降解法。雖然其原理大相徑庭，但這兩種方法都是同樣生成互相獨立的若干組帶放射性標記的寡核苷酸，每組寡核苷酸都有固定的起點，但卻隨機終止于特定的一種或者多種殘基上。由于DNA上的每一個堿基出現(xiàn)在可變終止端的機會均等，因些上述每一組產(chǎn)物都是一些寡核苷酸混合物，這些寡核苷酸的長度由某一種特定堿基在原DNA全片段上的位置所決定。然后在可以區(qū)分長度僅差一個核苷酸的不同DNA分子的條件下，對各組寡核苷酸進行電泳分析，只要把幾組寡核苷酸加樣于測序凝膠中若干個相鄰的泳道這上，即可從凝膠的放射自影片上直接讀出DNA上的核苷酸順序。

一、Sanger雙脫氧鏈終止法[點擊查看詳情]

二、Maxam－Gilbert DNA化學降解法

與包括合成反應(yīng)的鏈終止技術(shù)不同，Maxam-Gilbert法要對原DNA進行化學降解。這一方法是在體外研究lac阻抑制與lac操縱基因相互作用時醞釀發(fā)展起來的。時至今日，可以探測DNA構(gòu)象的蛋白質(zhì)－DNA相到作用，仍然是Maxam- Gilbert法*的鮮明特點。在這一方法（Maxam和Gilbert，1980）中，一個末端標記的DNA片段在5組互相獨立的的化學反應(yīng)分別得到部分降解，其中每一組反應(yīng)特異地針對某于種或某一類堿基。因此生成5組放射性標記的分子，從共同起點（放射性標記末端）延續(xù)到發(fā)生化學降解的位點。每組混合物中均含有長短不一的DNA分子，其長度取決于該組反應(yīng)所針對的堿基在原DNA全片段上的位置。此后，各組均通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，再通過放射自顯影來檢測末端標記的分子。相對而言，Maxam-Gilbert法自初次提出以來，基本沒有變化。雖然設(shè)計了另一些化學降解反應(yīng)（見綜述：Ambrose和Pless，1987），但這些反應(yīng)一般只作為Maxam和Gilbert(1977，1980)zui早提出的反應(yīng)的補充。這一方法的成敗，*取決于上述這些佞兩步進行的降解反應(yīng)的特異性。*步先對特定堿基（或特定類型的堿基）進行化學修飾，而第二步修飾堿基從糖環(huán)上脫落，修飾堿基5"和3"的磷酸二酯鏈斷裂。在每種情況下，這些反應(yīng)都要在精心控制的條件下進行，以確保每一個DNA分子平均只有一個靶堿基被修飾。隨后用哌啶裂解修飾堿基的5"和3"位置，得到一組長度從一到數(shù)百個核苷酸不等的末端標記分子。比較G、A＋G、C＋T、C和A>C各個泳道， 右從測序凝膠的放射自顯影片上讀出DNA序列。由于種種原因（如采用32P進行放射性標記、末端標記DNA的比活度、裂解位點的統(tǒng)計學分布、凝膠技術(shù)方面的局限性等等），Maxam-Gilber法所能測定的長充要比Sanger法短一些，它對放射性標記末端250個核苷酸以內(nèi)的DNA序列效果*。在70年代Maxam-Gilbert法和Sanger法剛剛問世時，利用化學降解進行測序不但重現(xiàn)性更高，而且也容易為普通研究人員所掌握。Sanger 法南非要單鏈模板和特異寡核苷酸的，并需獲得大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow 片段的高質(zhì)量酶制劑，而Maxam-Gilbert法只需要人所共的簡單化學試劑。但隨著M13 噬菌體和噬菌粒載體的發(fā)展，也由于現(xiàn)成的合成引物唾手可得及測序反應(yīng)日臻完善，雙脫氧鏈終止法如今遠比Maxam-Gilbert法應(yīng)用得廣泛。然而，化學降解較之鏈終止法具有一個明顯的優(yōu)點：所測序列來自原DNA分子而不是酶促合成所產(chǎn)生的拷貝。因此，利用Maxam-Gilbert法可對合成的寡核苷酸進行測序，可以分析諸如甲基化等DNA修飾的情況，不可以通過化學保護及修飾干擾實驗來研究DNA二級結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)與DNA的相互作用。然而，由于Sanger法既簡便又快速，因此是現(xiàn)今的*選擇方案。事實上，目前大多數(shù)測序策略都是為Sanger法而設(shè)計的。 類核苷酸類惟物的耐受性看來也優(yōu)于原來的測序酶。