活性氧檢測(cè)試劑盒

使用說(shuō)明書(shū)

活性氧檢測(cè)試劑盒操作步驟：

一、試劑準(zhǔn)備：

1. dcfh-da可稀釋于培養(yǎng)基或緩沖液中。血清或培養(yǎng)基顏色并不影響dcfh-da及細(xì)胞內(nèi)熒光產(chǎn)生，但可能會(huì)影響熒光顯微鏡觀察，干擾熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀熒光測(cè)定?？蓪?/span>dcfh-da稀釋于無(wú)酚紅培養(yǎng)基或適宜的緩沖液如pbs中。這依賴于使用何種熒光設(shè)備進(jìn)行測(cè)定。

2. 加入dcfh-da的時(shí)機(jī)或孵育時(shí)間，以zui終能順利檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧為目的。藥物處理時(shí)間較短(<2小時(shí))或預(yù)計(jì)ros效應(yīng)較弱，可先加或同時(shí)加入dcfh-da。反之，treat 刺激時(shí)間較長(zhǎng)(>6 小時(shí))或預(yù)計(jì)產(chǎn)生ros效應(yīng)較強(qiáng)，可后加dcfh-da。

3. 活性氧供體含高純度12 mm h2o2。加入細(xì)胞后其本身即是一種活性氧，而且在代謝過(guò)程中可產(chǎn)生其它類型的活性氧，均可使dcfh-da氧化為dcf呈現(xiàn)強(qiáng)綠色熒光。因而，用戶可使用該試劑作為測(cè)試實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)或儀器的陽(yáng)性試劑，以初步觀察細(xì)胞活性氧所產(chǎn)生的熒光的一般特征，并且也可以將該實(shí)際作為實(shí)驗(yàn)的一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照。*該試劑的細(xì)胞工作濃度為20~100 μm或更低濃度，但超過(guò)200μm將產(chǎn)生細(xì)胞毒。如果用戶熟悉ros熒光或?qū)嶒?yàn)沒(méi)有必要采用陽(yáng)性對(duì)照，可以不加該試劑。

二、加入熒光探針：

1. 加入dcfh-da于培養(yǎng)基，*初始工作濃度為10 μm。對(duì)不同的細(xì)胞和處理，dcfh-da工作濃度可為100 nm~20 μm，需進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定合適的濃度?？傮w稀釋倍數(shù)應(yīng)在1:500~1000以上以避免dmso對(duì)細(xì)胞的影響。以dmso作為溶劑對(duì)照。

2. 37 oc 孵育細(xì)胞30min~至幾個(gè)小時(shí)，通常30-60min 即可。孵育時(shí)間長(zhǎng)短與細(xì)胞類型、刺激條件、dcfh-da濃度有關(guān)。

3. pbs洗滌細(xì)胞2次。

三、活性氧檢測(cè)試劑盒熒光檢測(cè)

采用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡圖像檢測(cè)照相，綠色熒光強(qiáng)度代表活性氧水平。也可進(jìn)行微板熒光分析儀(multiwell fluorescence plate reader)實(shí)時(shí)或每10分鐘分時(shí)逐點(diǎn)檢測(cè)熒光強(qiáng)弱。對(duì)于流式細(xì)胞儀可將細(xì)胞

用*消化pbs洗滌后重懸檢測(cè)。