我們開始先用VLCDR3隨機(jī)化，是因?yàn)樗话惚萔HCDR3短，更重要的原因是可以在同源結(jié)構(gòu)上建模。VLCDR3隨機(jī)化技術(shù)也較VHCDR3簡單一些，這是因?yàn)樗挥趕cFv基因的3，端。因此，隨機(jī)化過程只需兩步PCR即可完成。在*步PCR中，隨機(jī)化引物（VLFOR）和引物L(fēng)MB3可以擴(kuò)增大部分scFv基因，并將突變導(dǎo)人CDR3。第二步PCR擴(kuò)增scFv的其余部分，并添加1個(gè)用于片段克隆的限制性位點(diǎn)。

多樣化VL CDR3構(gòu)建scFv基因文庫的策略。
隨機(jī)化VLCDR3分兩步PCR進(jìn)行。在*步PCR中，隨機(jī)化引物（VLFOR）和引物L(fēng)MB3可以擴(kuò)增大部分scFv基因，并將突變導(dǎo)人CDR3。第二步PCR擴(kuò)增scFv的其余部分，并添加1個(gè)用于片段克隆的限制性位點(diǎn)NotI

現(xiàn)在可以用添加了NotI限制性位點(diǎn)的引物再擴(kuò)增scFvVI-基因文庫。用NcoI和NotI消化再擴(kuò)增的產(chǎn)物，克隆到噬菌體展示載體pHENl中，并將產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化人大腸桿菌。

建文庫后，可選擇和篩選的更高親和力抗體。我們通常采用來自VLCDR3突變中親和力zui高的突變體，作為VHCDR3突變的起始抗體。

用于VLCDR3多樣化的引物定位和設(shè)計(jì)。
用于CDR3隨機(jī)化的引物是以進(jìn)行親和力成熟的抗體V基因序列為基礎(chǔ)的。VL CDR3（下劃線區(qū)域）中7個(gè)氨基酸被隨機(jī)化?？蚣?（FR3）末端和框架4（FR4）起始端用實(shí)線標(biāo)出