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上海金穗生物科技有限公司

制備用于抗原上選擇的噬菌體抗體

時(shí)間:2012-12-26閱讀:372
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轉(zhuǎn)化后,就得到了菌苔形式的抗體文庫??梢灾苽涑筛视蛢?chǔ)存物保存于一80℃。這是一個(gè)原始文庫,象征著具有*價(jià)值的資源。的抗體文庫也是由這種原始文庫制備而來的。然而,當(dāng)用大培養(yǎng)板鋪板擴(kuò)增原始文庫時(shí),會(huì)造成部分多樣性的丟失。因此在任何噬菌體制備或細(xì)菌擴(kuò)增步驟中,接種量必須總是大于5倍的文庫容量,從而保持文庫的多樣性。

在大多數(shù)噬菌體展示載體中,抗體片段的表達(dá)是由lacZ啟動(dòng)子啟動(dòng)的。盡管這個(gè)啟動(dòng)子存在某些漏洞并可以優(yōu)化,但以以下一些指導(dǎo)進(jìn)行操作,其效果依然良好。在噬菌體救援前,含有抗體文庫的細(xì)菌在葡萄糖存在的條件下,可生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期。葡萄糖可抑制lacZ啟動(dòng)子的活性,因此使pⅢ和抗體表達(dá)都下降。這就有兩點(diǎn)重要作用:一是由于pⅢ和抗體產(chǎn)生的毒性下降,防止了文庫的偏性發(fā)生;二是抑制了pⅢ表達(dá)就可允許細(xì)菌纖毛表達(dá),從而使輔助噬菌體能進(jìn)行感染。如果沒有葡萄糖,感染效率會(huì)急劇下降,結(jié)果大大降低了抗體文庫的有效容量:輔助噬菌體感染后,則須去除葡萄糖,以便讓pⅢ和抗體進(jìn)行表達(dá)。而后,低水平lacZ啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)pⅢ表達(dá),但這已足以進(jìn)行有效的展示了。用異丙基硫代半乳糖苷(1PTG)誘導(dǎo)啟動(dòng)子達(dá)不到預(yù)期效果,反而大大降低了展示水平。這是由pⅢ和抗體融合蛋白的毒性及pⅢ抗體融合蛋白的降解所致。對(duì)于scFv文庫和Fab文庫,過夜生長(zhǎng)階段的典型溫度是30℃;此溫度下,抗體展示水平似乎更佳。選擇前,先用PEG沉淀法從培養(yǎng)基上清中制備噬菌體。這樣就可以去除不*抑制或蛋白水解切除所產(chǎn)生的抗體片段。這些抗體片段能與噬菌體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。PEG沉淀也可以去除其他任何能干擾選擇的污染物。如果計(jì)劃長(zhǎng)期保存噬菌體,推薦接著進(jìn)行氯化銫離心純化。
 

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