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上海金穗生物科技有限公司

制備用于抗原上選擇的噬菌體抗體

時間:2012-12-26閱讀:363
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轉(zhuǎn)化后,就得到了菌苔形式的抗體文庫。可以制備成甘油儲存物保存于一80℃。這是一個原始文庫,象征著具有*價值的資源。的抗體文庫也是由這種原始文庫制備而來的。然而,當(dāng)用大培養(yǎng)板鋪板擴增原始文庫時,會造成部分多樣性的丟失。因此在任何噬菌體制備或細(xì)菌擴增步驟中,接種量必須總是大于5倍的文庫容量,從而保持文庫的多樣性。

在大多數(shù)噬菌體展示載體中,抗體片段的表達(dá)是由lacZ啟動子啟動的。盡管這個啟動子存在某些漏洞并可以優(yōu)化,但以以下一些指導(dǎo)進(jìn)行操作,其效果依然良好。在噬菌體救援前,含有抗體文庫的細(xì)菌在葡萄糖存在的條件下,可生長至對數(shù)期。葡萄糖可抑制lacZ啟動子的活性,因此使pⅢ和抗體表達(dá)都下降。這就有兩點重要作用:一是由于pⅢ和抗體產(chǎn)生的毒性下降,防止了文庫的偏性發(fā)生;二是抑制了pⅢ表達(dá)就可允許細(xì)菌纖毛表達(dá),從而使輔助噬菌體能進(jìn)行感染。如果沒有葡萄糖,感染效率會急劇下降,結(jié)果大大降低了抗體文庫的有效容量:輔助噬菌體感染后,則須去除葡萄糖,以便讓pⅢ和抗體進(jìn)行表達(dá)。而后,低水平lacZ啟動子驅(qū)動pⅢ表達(dá),但這已足以進(jìn)行有效的展示了。用異丙基硫代半乳糖苷(1PTG)誘導(dǎo)啟動子達(dá)不到預(yù)期效果,反而大大降低了展示水平。這是由pⅢ和抗體融合蛋白的毒性及pⅢ抗體融合蛋白的降解所致。對于scFv文庫和Fab文庫,過夜生長階段的典型溫度是30℃;此溫度下,抗體展示水平似乎更佳。選擇前,先用PEG沉淀法從培養(yǎng)基上清中制備噬菌體。這樣就可以去除不*抑制或蛋白水解切除所產(chǎn)生的抗體片段。這些抗體片段能與噬菌體競爭結(jié)合。PEG沉淀也可以去除其他任何能干擾選擇的污染物。如果計劃長期保存噬菌體,推薦接著進(jìn)行氯化銫離心純化。
 

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