1．從新鮮（時(shí)間不超過(guò)1周）的2YT／tet平板上挑取單個(gè)大腸桿菌SS320的克隆，接種到lml 2 YT／tet培養(yǎng)基中。37℃200r／min孵育6～8小時(shí)。轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基到含有50m1 2YT／tet培養(yǎng)基的500ml帶塞錐形瓶中。37℃200r／min培養(yǎng)過(guò)夜。
2．將5m1過(guò)夜培養(yǎng)基接種于分別含有900m1超級(jí)肉湯／tet培養(yǎng)基的6個(gè)2L帶塞錐形瓶中。37℃200r／min培養(yǎng)細(xì)胞至OD600＝0。6-0．8（3-4小時(shí)）。
3．冰上冷卻3個(gè)錐形瓶5分鐘，間歇渦旋混勻。
注意：下面的步驟應(yīng)該在4℃冷室，冰上完成，并且使用預(yù)冷的試劑和儀器。
4．用GS3轉(zhuǎn)子（5000g）4℃55000r／rain離心細(xì)胞5分鐘，使用可以迅速降速的離心機(jī)（例如Sorvall RC5B Plus），棄去上清。將剩下3個(gè)錐形瓶中的培養(yǎng)基（當(dāng)*組正在離心時(shí)，它們應(yīng)該處于冷卻環(huán)境下）加入到相同的管子中，重復(fù)離心并棄去上清。
5．用pH 7．4，1．0mmol／L的Hepes裝滿每個(gè)離心管。加入一個(gè)無(wú)菌的磁性轉(zhuǎn)子到每管中以促進(jìn)沉淀重懸。簡(jiǎn)短地渦旋振蕩沖下管壁上的沉淀并以一個(gè)溫和的速度攪拌至沉淀*重懸。
6．用GS3轉(zhuǎn)子4℃55000r／min離心10分鐘，棄去上清。在傾倒過(guò)程中，將攪拌棒留在離心管中，使其留在與沉淀相反的一面。 當(dāng)從轉(zhuǎn)子中取出離心管時(shí)， 小心維持離心管的角度以免攪亂沉淀。
7．用同樣體積的1．Omm01／L的Hepes（如第5步）重懸細(xì)胞。用GS3轉(zhuǎn)子4℃S5000r／min離心10分鐘，棄去上清。用150mll0％超純甘油重懸每個(gè)沉淀。不要把沉淀混在一起。
8．用GS3轉(zhuǎn)子4℃55000r／min離心細(xì)胞15分鐘。棄去上清并拿走攪拌棒。用移液器去掉剩余的少量上清。每管加入3．Oml 10％超純甘油并用移液器重懸沉淀。轉(zhuǎn)移懸浮液到另外一管并重復(fù)操作，使所有沉淀都重懸浮。
9．將350ul的一份分裝于1．5m1微型離心管中的液體快速冰凍。這個(gè)實(shí)驗(yàn)方案能制備約12m1濃度為3×1011cfu／ml的細(xì)胞。