1．實驗材料
（1）肽庫：美國NewEnglandBiolabs的環(huán)狀7肽庫（Ph，D-C7CTm Phage Display Peptide LibraryKit）。
（2）人正常細胞株和人腫瘤細胞株。
（3）裸鼠。
2．實驗器材和常用試劑
同蛋白質(zhì)分子為篩選靶目標的實驗方法。
3．實驗方法
1）目標噬菌體的初篩
（1）荷瘤裸鼠動物模型的準備：選用4～6周齡雌性健康BALB/c裸鼠數(shù)只，于SPF級動物實驗室常規(guī)無菌培養(yǎng)，待用。選取生長狀態(tài)良好的肝癌細胞，*常規(guī)消化后用含有20％新生牛血清的RPMll640*培養(yǎng)基重懸，細胞計數(shù)后，調(diào)節(jié)細胞濃度達到107個細胞/ml。將重懸好的細胞，用1m1的無菌一次性注射器在裸鼠右側(cè)腋下，采用皮下注射的方法將200ul（約5×106個）的腫瘤細胞注射到裸鼠體內(nèi)。約3～4周后腫瘤達到可供使用的大小。
（2）荷瘤裸鼠經(jīng)乙mi麻醉后，將1011噬菌體肽文庫靜脈注射人荷瘤裸鼠體內(nèi)（這些噬菌體經(jīng)過血液循環(huán)后，含肝癌細胞特異性肽的噬菌體將會吸附于肝癌細胞上或被癌細胞內(nèi)吞），5min后用10ml的DMEM、100m1生理鹽水對小鼠進行心臟灌流。取出裸鼠一部分腫瘤組織用PBS洗3次，研磨后，加入20 ml預先制備好的大腸桿菌感受態(tài)細胞，37℃、230r/rain振蕩培養(yǎng)4．5h，分別檢測從腫瘤回收的噬菌體及其擴增后的效價。
（3）荷瘤裸鼠繼續(xù)用多聚甲醛固定液灌流至肝臟變白，取下荷瘤裸鼠的主要器官和一部分腫瘤組織，浸入3％多聚甲醛固定，以備組織切片用。
（4）從裸鼠的腫瘤組織回收噬菌體含有能特異性吸附于腫瘤組織的多肽，對回收得到的噬菌體庫用上述相同的方法再進行1次體內(nèi)循環(huán)篩選，即得到了初篩的目標噬菌體。
2）噬菌體單克隆的擴增及純化：同以細胞為靶目標的篩選。
3）目標噬菌體克隆的鑒定
（1）噬菌體在體內(nèi)組織分布的免疫組織化學鑒定：取出浸在3％多聚甲醛中的組織樣品，自然干燥后，切片后貼到玻片上，晾干，丙酮固定5rain，PBST洗3次，每次3min。1％過氧化氫甲醇混合液室溫浸泡30min，PBST洗3次，每次5min。5％脫脂奶粉室溫封阻20rain，加入按1：1 000稀釋的噬菌體M13抗血清，37℃濕盒中溫育1h，PBST洗3次，每次5rain。加入1：300稀釋的HRP標記的羊抗兔IgG，37℃濕盒中溫育1 h，PBST洗3次，每次5rain。DAB進行顯色反應（約12 rain），用流水終止反應；蘇木青復染細胞核約3rain，自來水沖洗；加飽和*分色，用乙醇逐級脫水，二甲苯3rain透明，zui后用中性樹脂封片觀察。
（2）體外培養(yǎng)細胞水平的鑒定：同以細胞為靶目標的篩選。
