埃茲蛋白抗體相關(guān)信息

Western bloting要注意的一些問題
1、為了讓實(shí)驗(yàn)更加嚴(yán)謹(jǐn)有說服力都要設(shè)計(jì)對照實(shí)驗(yàn)，對照分為：陽性對照（有標(biāo)準(zhǔn)品（比如β-actin，GAPDH）或陽性血清）；陰性對照（測血時用相應(yīng)小鼠未免疫血清（即正常血）；空白對照（不加一抗，用PBS代替）；無關(guān)對照（用無關(guān)抗體）
2、一抗、二抗的濃度一般要參照抗體說明書選擇zui適當(dāng)?shù)谋壤?，一抗二抗的選擇直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及背景的深淺。
3、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時所釆用的抗原批次要一樣，盡量的避免人為的帶來個體差異。特別在做裂解液時更要注意所釆用的操作條件，盡可能的排除可變因素給實(shí)驗(yàn)帶來不確定性。
4、凝膠的質(zhì)量直接影響以后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，要特別注意幾點(diǎn)：凝膠要均一沒有氣泡；積層膠與分離膠界面要水平；AP和TEMED的量不能過多，太多會導(dǎo)致膠易脆裂；拔梳子時要快，盡量保證點(diǎn)樣孔平整。
5、電泳、轉(zhuǎn)膜時特別要注意正負(fù)極，電壓電流都不能過高；轉(zhuǎn)膜時“三明治”的疊放次序不錯，同時要防止產(chǎn)生氣泡；盡量讓電轉(zhuǎn)溫度保持在10度以下，冰浴為宜。
6、封閉時一般在室溫下2h就夠了，但是要注意如果是*標(biāo)記的二抗就不宜用牛奶，因?yàn)榕Ｄ讨泻?，用BSA效果更好。
7、加一抗二抗要嚴(yán)格保證反應(yīng)時間，洗膜要注意盡可能地將一抗二抗洗凈，有利于降低背景；還要注意一抗二抗的匹配。
8、在顯色發(fā)光時要特別注意二抗所對應(yīng)的顯色方法，特別是在發(fā)光時要注意發(fā)光時間和顯影時間的控制，以看得清楚目的條帶為標(biāo)準(zhǔn)。
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四、Western bloting在抗體生產(chǎn)中的應(yīng)用
     Western bloting是用來對蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測的一種常用方法，通過抗原抗體的免疫反應(yīng)可以定量測出抗體的相對分子量，以及抗體的相對豐度或與已知抗原的關(guān)系等等。目前它應(yīng)用在多個領(lǐng)域,在臨床上檢測傳染病和自身免疫病、過敏癥等，在抗體生產(chǎn)領(lǐng)域它與ELISA、ICC、IHC、IFA等免疫技術(shù)相接合已成為單克隆抗體生產(chǎn)的主要篩選手段。
     在單抗的篩選過程中通常釆用幾中免疫技術(shù)并存的方式進(jìn)行篩選，針對不同的抗體釆用不同的技術(shù)，有利于提搞抗體生產(chǎn)的篩選效率，下面就針對幾種常用的方法與Western blot進(jìn)行比較：
方法        ELISA        WB        IHC/ICC        免疫熒光（IFA）
操作        簡單，周期短        復(fù)雜，周期長        較簡單        較簡單（要專門的熒光顯微鏡）
靈敏度        高，易產(chǎn)生假陽性        高，特異性高        較WB低        較ICC高
交叉        有.        有，易識別（根據(jù)抗原分子的大小）        有，難識別        有
準(zhǔn)確度        定性        定性定分子量        定位        定位
載體        酶標(biāo)板        凝膠、膜        玻片        玻片
結(jié)果        普通顯色        化學(xué)化光/普通顯色        普通顯色        熒光
在抗體檢測中Western bloting經(jīng)常要注意到目標(biāo)抗體與抗原（細(xì)胞/組織裂解液）的接合能力，特別是交叉現(xiàn)象，所以一定要設(shè)置好對照實(shí)驗(yàn)。同時還有測血、測母克隆亞克隆過程中一定要注意抗體的稀釋倍數(shù)以及二抗的使用等等。
總而言之，做Wetern bloting實(shí)驗(yàn)熟練撐握原理和操作是前提，關(guān)鍵是統(tǒng)籌整個實(shí)驗(yàn)流程，合理安排，注意細(xì)節(jié)，這樣才能保證實(shí)驗(yàn)的性和準(zhǔn)確性。