1）-10℃甲醇溶液5min，自然干燥（推薦方法）；或

2）冰丙酮2min，自然干燥；或

3）1%甲醛-PBS 10min（保持濕潤(rùn)）。

PBS洗三次。

可選擇：含0.1-1%過(guò)氧化氫的PBS孵育5-10min，淬滅內(nèi)源過(guò)氧化物酶活性。PBS洗2次，5min/次。

95%乙醇清潔玻片，涂一薄層黏附劑，自然晾干。或使用預(yù)處理的玻片。

切片厚度4-10μm。室溫貼片。切片保存在-70℃。固定染色前室溫解凍切片。

可選擇：含0.1-1%過(guò)氧化氫的PBS孵育5-10min，淬滅內(nèi)源過(guò)氧化物酶活性。PBS洗2次，5min/次。

注意：組織內(nèi)有豐富的*（引起高背景染色），建議甲醛固定，遵循石蠟包埋組織切片protocol，因?yàn)槭灠窠M織中內(nèi)源性*被破壞。

95%乙醇清潔玻片，涂一薄層黏附劑，自然晾干?；蚴褂妙A(yù)處理的玻片。

切片厚度4-6μm。二甲苯脫蠟，3次，5min/次。依次過(guò)梯度酒精水化：100%乙醇，2次，10min/次，95%乙醇，2次，10min/次。去離子水浸洗1min。甩去切片上多余的液體。

*：切片用含0.1%*的0.01N HCl室溫孵育10-20min。去離子水沖洗幾次，甩去多余液體。

皂角苷：切片用含0.05%皂角苷的去離子水室溫孵育30min。PBS至少洗3次，甩去多余液體。

所有反應(yīng)步驟均于室溫下濕盒內(nèi)完成。使用前試劑盒試劑要先恢復(fù)至室溫。操作中切片不能過(guò)干。每步操作完用吸引管吸除試劑，避免切片過(guò)干。要用足夠的反應(yīng)液覆蓋標(biāo)本（通常100μl/張切片就足夠了）。

滴加*抗體室溫孵育30min或4℃過(guò)夜孵育?？贵w*反應(yīng)濃度需經(jīng)滴定確定；建議用含1.5%封閉血清的PBS稀釋至0.5-5.0μg/ml。PBS洗3次，5min/次。

滴加預(yù)稀釋的*化第二抗體或用含1.5%封閉血清的PBS稀釋至1μg/ml的*化第二抗體，孵育30min。PBS洗3次，5min/次。

滴加親和素*酶反應(yīng)物，孵育30min。PBS洗3次，5min/次。

用提供的過(guò)氧化物酶底物孵育30s-10min或直至出現(xiàn)理想染色止。注意監(jiān)控單張切片的恰當(dāng)顯色時(shí)間。去離子水洗5min?？捎锰K木素（sc-24973）復(fù)染5-10s。迅速用去離子水洗幾次。

 梯度酒精，二甲苯依次脫水：浸沒(méi)入95%乙醇2次，10s/次，然后100%乙醇2次，10s/次，zui后二甲苯3次，10s/次。擦掉多余的二甲苯。迅速加1-2滴封片固定劑（如Clarion，sc-24942），蓋上蓋玻片（sc-24975），光學(xué)顯微鏡下觀察。

迅速加入1-3滴預(yù)稀釋的*抗體。如果所用染色系統(tǒng)不含預(yù)稀釋的抗體，就把*抗體用血清封閉液稀釋至0.5-5.0μg/ml。孵育2hrs。PBS沖洗，然后切片浸沒(méi)入PBS內(nèi)洗2次，2min/次。甩去多余的液體。

滴加1-3滴*化第二抗體，孵育30min。清洗同上步。

滴加1-3滴HRP-鏈親和素復(fù)合物，孵育30min。清洗同上步。

滴加1-3滴HRP底物混合物。顯色30s-10min，或直至出現(xiàn)理想染色止。去離子水沖洗，然后切片浸沒(méi)入去離子水內(nèi)洗2次，2min/次。

復(fù)染，脫水，封片。（同ABC染色試劑盒）

每步操作完吸除反應(yīng)液，但要避免樣品過(guò)干。用足夠的反應(yīng)液覆蓋樣品（100-500μl/張切片）。

滴加含10%封閉血清-PBS，孵育20min，減少和IgG結(jié)合的非特異位點(diǎn)。理想的封閉血清和第二抗體為同種屬來(lái)源。從切片上去除封閉血清。

滴加*抗體，孵育60min。抗體*反應(yīng)濃度應(yīng)滴定決定；建議用含1.5%封閉血清的PBS稀釋至0.5-5.0μg/ml，PBS洗3次，5min/次。

滴加*標(biāo)記或熒光染料標(biāo)記的第二抗體（用含1.5%-3%封閉血清的PBS稀釋至1-5μg/ml），孵育45min。PBS洗3次。如果使用熒光染料標(biāo)記的第二抗體，須暗室孵育，并省略下步。

滴加鏈親和素-熒光素，暗室孵育15min。鏈親和素標(biāo)記物濃度需經(jīng)滴定決定；建議PBS稀釋至10-20μg/ml。PBS充分洗凈。

用水相固定劑或90%甘油PBS溶液封片。

選擇適當(dāng)?shù)臑V鏡在熒光顯微鏡下觀察。室溫避光保存切片（UltraCruz^TM固片劑：sc-24941）或保存在4℃（甘油/PBS固片劑）。

細(xì)胞表面染色

1）   溶解血紅細(xì)胞。（注意：準(zhǔn)備足夠的細(xì)胞用于10份樣品100μl/份檢測(cè)）。

1ml全血加入14ml恢復(fù)至室溫的1×FCM溶解液（sc-3621）中。

輕輕混勻，室溫孵育3-5min。不要超過(guò)5min。

離心5min，棄上清，預(yù)冷的5ml 1×PBS輕輕重懸沉淀。

離心5min，棄上清，預(yù)冷的1ml 1×PBS輕輕重懸沉淀。

2）準(zhǔn)備培養(yǎng)細(xì)胞。（注意：本protocol通常處理50ml培養(yǎng)細(xì)胞。單層細(xì)胞，切勿*消化！用0.2%EDTA/PBS溶液代替。1×PBS洗細(xì)胞1次。）

*計(jì)數(shù)細(xì)胞。

1000rpm離心5min，棄上清，用足夠的1×PBS輕輕重懸沉淀至終濃度為1×10⁷細(xì)胞/ml。

每管加入100μl RBC溶解的全血或單細(xì)胞懸液?；靹?，放在有蓋的冰盒內(nèi)孵育15-30min。

每管加入1.5ml FCM沖洗緩沖液（sc-3624），顛倒混勻。1000rpm離心5min，棄上清，500μl 1%多聚甲醛重懸沉淀。

測(cè)讀分析數(shù)據(jù)。