辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗季節(jié)性A型人流感病毒H1N1抗體IgG（美國加州型）

Western bloting首先是要將電泳后分離的蛋白從凝膠中轉(zhuǎn)移到NC膜上，通常有兩種方法：毛細(xì)管印跡法和電泳印跡法。毛細(xì)管印跡法是將凝膠放在緩沖液浸濕的濾紙上，在凝膠上放一片NC膜，再在上面放一層濾紙等吸水物質(zhì)并用重物壓好，緩沖液就會通過毛細(xì)作用流過凝膠。緩沖液通過凝膠時會將蛋白質(zhì)帶到NC膜上，NC膜可以與蛋白質(zhì)通過疏水作用產(chǎn)生不可逆的結(jié)合。但是這種方法轉(zhuǎn)移效率低，通常只能轉(zhuǎn)移凝膠中的一小部分蛋白質(zhì)（10%-20%）。而電泳印跡可以更快速有效的進(jìn)行轉(zhuǎn)移。這種方法是用有孔的塑料和有機玻璃板將凝膠和NC膜夾成“三明治”形狀，而后浸入兩個平行電極中間的緩沖液中進(jìn)行電泳，選擇適當(dāng)?shù)碾娪痉较蚓涂梢允沟鞍踪|(zhì)在電場力的作用下離開凝膠結(jié)合到NC膜上。常用的電泳轉(zhuǎn)移方法有濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)。兩者的原理*相同，只是用于固定膠/膜疊層和施加電場的機械裝置不同。濕轉(zhuǎn)是一種傳統(tǒng)方法，將膠/膜疊層浸入緩沖液槽然后加電壓。這是一種有效方法但比較慢，需要大體積緩沖液且只能用一種緩沖液。半干轉(zhuǎn)移，用浸透緩沖液的多層濾紙代替緩沖液槽。與濕轉(zhuǎn)相比，這種方法要快（15-45 分鐘）。
轉(zhuǎn)移后的NC膜就稱為一個印跡（blot）,用于對蛋白質(zhì)的進(jìn)一步檢測。印跡首先用蛋白溶液（如10%的BSA或脫脂奶粉溶液）處理以封閉NC膜上剩余的疏水結(jié)合位點，而后用所要研究的蛋白質(zhì)的抗體（一抗）處理，印跡中只有待研究的蛋白質(zhì)與一抗特異結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，而其它的蛋白質(zhì)不能與一抗結(jié)合，這樣清洗除去未結(jié)合的一抗后，印跡中只有待研究的蛋白質(zhì)的位置上結(jié)合著一抗。處理過的印跡進(jìn)一步用適當(dāng)標(biāo)記的二抗處理，二抗是指一抗的抗體，如一抗是從鼠中獲得的，則二抗就是抗鼠IgG的抗體。處理后，帶有標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合形成抗體復(fù)合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白質(zhì)的位置。目前有結(jié)合各種標(biāo)記物的抗體特定IgG的抗體（二抗）可以直接購買，zui常用的一種是酶連的二抗，印跡用酶連二抗處理后，再用適當(dāng)?shù)牡孜锶芤禾幚?，?dāng)酶催化底物生成有顏色的產(chǎn)物時，就會產(chǎn)生可見的區(qū)帶，指示所要研究的蛋白質(zhì)位置。在酶連抗體中使用的酶通常是堿性磷酸酶（AP）或辣根過氧化物酶（HRP）。堿性磷酸酶可以將無色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸鹽（BCIP）轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物；而辣根過氧化物酶可以將H2O2為底物，將3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色產(chǎn)物或?qū)?/span>4-氯萘酚氧化成藍(lán)色產(chǎn)物。另一種檢測辣根過氧化物酶的方法是用增強化學(xué)發(fā)光法，辣根過氧化物酶在H2O2存在下，氧化化學(xué)發(fā)光物質(zhì)魯米諾并發(fā)光，通過將印跡放在照相底片上感光就可以檢測出辣根過氧化物酶的存在，即目標(biāo)蛋白質(zhì)的存在了。除了酶連二抗作為指示劑，也可以使用其它指示劑，比如：熒光素異硫氰酸鹽標(biāo)記的二抗（可通過紫外燈產(chǎn)生熒光）；*結(jié)合的二抗等等。
除了使用抗體或蛋白作為檢測特定蛋白的探針以外，有時也使用其它探針如放射性標(biāo)記的DNA，可以檢測印跡中的DNA結(jié)合蛋白。
在Western bloting實驗中，有另一種方法，就是直接標(biāo)記一抗，再用底物顯色。這種方法叫直接法，與用二抗的間接法相比有諸多不足，標(biāo)記二抗可用于很多種不同特異性的一抗，避免了標(biāo)記很多一抗的需要，同時因為一抗結(jié)合不止一個二抗分子，所以二抗可以增強信號。所以一般情況下都釆用間接法進(jìn)行檢測。