熒光素標(biāo)記電壓依賴(lài)性陰離子通道抗體IgG

SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDS－PAGE）
①根據(jù)要求配制好SDS-聚丙烯酸胺凝膠（一般釆用10%的SDS－PAGE）
②將已配制好的凝膠裝入電泳儀中（注意不要漏液）。
③設(shè)計(jì)加樣順序，作好實(shí)驗(yàn)記錄，按預(yù)定順序加樣。一般裂解液我們按10-20ul/道點(diǎn)樣，重組蛋白按1-2ug/道點(diǎn)樣。
④把電泳裝置與電源連接好，將電壓調(diào)至100V電泳10-20min，待溴酚藍(lán)遷移出積層膠位置再換用200V，30-40min后關(guān)閉電源。
⑤從電泳裝置上卸下凝膠玻璃板，用水沖洗干凈，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜。

蛋白質(zhì)樣品（抗原）的制備：
①  細(xì)胞的處理方法：向收集到的細(xì)胞中加入RIPA裂解緩沖液（三中蛋白酶抑制在使用前加入，終濃度為2ug/ml）在冰上裂解30—60min，然后再插入冰盒進(jìn)行超聲，超聲強(qiáng)度以不產(chǎn)生泡沫為準(zhǔn)，超聲每次2-3秒，重復(fù)3-4次，再離心12000rpm3-5min，吸取上清備用。（超聲強(qiáng)度不能過(guò)大，防止蛋白碳化）
組織的處理方法：按實(shí)驗(yàn)要求將組織從動(dòng)物體內(nèi)取出（樣品不宜反復(fù)凍融），取少量（1-2g左右）放入玻璃勻槳器中研磨成勻漿，然后轉(zhuǎn)入EP管中進(jìn)行超聲，超聲強(qiáng)度以不產(chǎn)生泡沫為準(zhǔn)，超聲每次5-7秒，重復(fù)5-6次，再離心12000rpm3-5min，吸取上清備用。
②上述兩種方法得來(lái)的樣品處理液還要加入1/4體積左右的上樣Buffer，然后放在沸水浴中加熱3-4min使蛋白變性，方可作為樣品點(diǎn)樣。（注意：在加熱組織裂解液時(shí)，肝臟和腎臟組織要特別注意其本身濃度，是在制作裂解液時(shí)就適當(dāng)稀釋?zhuān)駝t加熱后會(huì)凝結(jié)成固態(tài)。還有些組織處理后很粘稠，有帶絲狀物，這是未裂解的核酸，可以適當(dāng)離心后再用。）