內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Aβ相關(guān)結(jié)合蛋白抗體，Anti-ERAB

從免疫血清純化抗體

1． 剪取一小條0.45 μm 的硝酸纖維膜，置于1.5ml eppendorf 管中，浸沒于1 ml
1 mg/ml 的抗原溶液中，5 min。
2． 取出膜，置于濾紙上干燥。
3． 將膜放置于裝有1 ml Buffer A 的eppendorf 管，輕輕震蕩混勻30 min。
4． 移去Buffer A，用新鮮的Buffer A 洗一次，將膜浸沒于0.8-1 ml 相應(yīng)的抗血
清中，1-2 h, 于混勻器上輕輕震蕩混勻。
5． 移去血清，用PBS 洗膜，4 次，每次5 min。
6． 洗脫抗體
新配置100 mM *（pH 2.5）抗體洗脫液，將膜置于洗液中，手輕搖
混勻2 min，迅速將洗液轉(zhuǎn)移至裝有100 μl 1 M Tris（pH 8.0）中和，使抗體
復性。第1 次洗脫用400 μl 抗體洗脫液，第2，3 次用200 μl。
7． 往洗脫下來的液體中加入100 μl Buffer A 以穩(wěn)定抗體，并分裝成30 μl 每管，
于-20℃保存。
注：所有步驟均在室溫完成。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Aβ相關(guān)結(jié)合蛋白抗體，Anti-ERAB

精制免疫球蛋白的方法很多。一般采用綜合技術(shù)，避免蛋白變性。如分離IgG時，多結(jié)合使 
用鹽析法與離子交換法，以求純化。提取IgM的方法也很多，如應(yīng)用凝膠過濾與制備電泳法，或離子交換與凝膠過濾等。

一、鹽析法
取x ml血清加x ml生理鹽水，于攪拌下逐滴加入2xml飽和硫酸銨，硫酸銨的終飽和度為50%。
↓4℃，3h以上，使其充分沉淀離心（3000rpm）,20min,充上清，以xml生理鹽水溶解沉淀，再逐滴加飽和硫酸銨x/2ml。
↓置4℃3h以上，[此時，（NH4）2SO4的飽和度為33%]重復上述第二步過程1～2次。末次離心后所得沉淀物為γ-球蛋白，以0.02%mol/L pH7.4PBS溶解至xml裝入透析袋。
↓對PBS充分透析、換液3次，至萘氏試劑測透析外液無黃色，即無NH4+為止。
取透析袋內(nèi)樣品少許作適當倍數(shù)稀釋后，以751型紫外分光光度計測定蛋白含量。
影響鹽析的因素很多，如蛋白質(zhì)的濃度，鹽的濃度，飽和度和pH，溫度等都可影響鹽析的結(jié)果，操作時要充分注意（參閱本章 第二節(jié) ）。
二、冷酒精沉淀法
分離過程如下。血清加3倍體積的蒸餾水，調(diào)節(jié) pH至7.7（±）冷卻到0℃。在激烈攪拌的條件下，加預(yù)冷的酒精（-20℃）到zui終濃度為20%，保持在-5℃。產(chǎn)生的沉淀（A），含有大多數(shù)種類的免疫球蛋白。沉淀A懸浮于25倍體積的0.15～20mol/L NaCl溶液（冷）中，加有0.05mol/L醋酸調(diào)節(jié) pH到5.1，產(chǎn)生的沉淀（B），包括大部分的IgA和IgM，IgG留在上清液內(nèi)。調(diào)節(jié) 上清液的pH到7.4，加冷酒精（-20℃～-30℃）到zui終濃度為25%，維持在-5℃。所得到的沉淀（C）含有90%～98%IgG。不同動物，IgG分離的條件和產(chǎn)量略有不同。見表2-5。從沉淀（B）可按下述方法進一步分離出IgA和IgM的混合物：將沉淀（B）懸浮在0℃ 水中，調(diào)節(jié) pH到5.1，離心去除不溶的蛋白。調(diào)節(jié) 上清液離子強度到0.01～0.0075,pH5.5。然后加冷酒精到zui終濃度為10%，保持在–2℃或-3℃低溫，所得的沉淀（B-B）主要含IgA和IgM。
表2-5 從幾種動物和人血清沉淀A分離IgM的條件
物 種   pH   沉淀條件   IgG產(chǎn)量
    酒精濃度（%）   離子強度   
人   5.1   15.   0.01   65
山羊   5.2   0   0.01   65
家兔   5.2   10   0.01   70
大鼠   5.0   15   0.01   50
豚鼠   5.1   15   0.01   70
三、DEAE-Sephadex A-50 柱層析純化免疫球蛋白
原理：DEAE-Sephadex A-50（二乙氨基—乙基-葡萄糖凝膠A-50）為弱堿性陽離子交換劑。用NaOH將Cl-型轉(zhuǎn)變?yōu)镺H-型后，可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白屬于中性蛋白（等電點為pH6.85～7.5），其余均屬酸性蛋白。PH7.2～7.4的環(huán)境中，酸性蛋白均被DEAE- Sephadex A-50吸附，只有γ球蛋白不被吸附。因此，通過柱層析，γ球蛋白便可在洗脫中先流出，而其他蛋白則被吸附在柱上，從而便可分離獲得純化的IgG.