單分子測序解析超級細菌

上海雙博生物科技有限公司的研究人員利用PacBio的單分子實時（SMRT）測序技術，解析了與腸桿菌（Enterobacteriaceae）相關的醫(yī)院獲得性感染中質粒介導的抗生素耐藥性。

研究人員從2011年爆發(fā)“超級細菌”的NIH醫(yī)院中采集了革蘭氏陰性的腸桿菌分離株，并分析了其中含有抗生素耐藥性酶的質粒。他們的研究結果顯示攜帶這些耐藥基因的背景質粒的廣泛多樣性，且許多耐藥性相關的質粒來自醫(yī)院環(huán)境內或外的獨立來源。

為了鑒定腸桿菌攜帶的編碼碳青霉烯酶的質粒，以及它們在細菌物種之間的移動，研究人員對臨床和醫(yī)院環(huán)境的腸桿菌分離株進行了全基因組測序，如肺炎克雷伯菌，產酸克雷伯菌和大腸桿菌，它們都含有一個或多個碳青霉烯耐藥的質粒。

研究小組主要關注與碳青霉烯酶相關的耐藥性，這涉及到所謂的KPC基因。研究人員解釋道，2011年NIH臨床中心有18名患者感染腸桿菌，其中就攜帶了包含KPC的質粒。

腸桿菌的碳青霉烯耐藥性也來源于另一種質粒，它包含由NDM1基因編碼的碳青霉烯酶。

在此次分析中，研究人員從NIH臨床中心的近1100名患者身上采集了樣本。這包括直腸、咽喉和/或腹股溝拭子，在2012-2013年期間從醫(yī)院的重癥監(jiān)護室和高危內科病房的患者中采集（每周兩次），以及從其他病房中采集的監(jiān)控樣本（每月一次），和新入院患者的樣本。

當他們篩查超過14,200個患者樣本及數(shù)百個從醫(yī)院環(huán)境中采集的樣本時，研究小組追蹤到10名患者，攜帶了包含KPC陽性質粒的腸桿菌。還有兩名患者在出院后被檢測出KPC腸桿菌呈陽性。

研究人員之前試圖利用短讀?。?/span>short-read）測序技術對含有KPC的質粒進行測序和追蹤，但遇到了一些問題。Segre解釋道，部分原因在于含有抗性基因的質粒往往含有大的、移動的遺傳元件。

她指出，以這項研究中的碳青霉烯耐藥性質粒為例，KPC基因的兩側伴有Tn4401轉座子，伸出去多達10,000個堿基。因此，在試圖鑒定每個細菌細胞中的多個質粒時就面臨挑戰(zhàn)。為了解決這個問題，研究人員決定利用PacBio的RSII系統(tǒng)來產生單分子的長讀取，這讓他們能夠同時查看細菌基因組的序列和質粒的序列。

利用這種方法，他們對2012-2013年鑒定出的12名KPC陽性患者的分離株進行了測序，同時對2011年爆發(fā)期間采集的2個分離株和醫(yī)院內的6個環(huán)境監(jiān)控樣本進行了測序。

總的來說，這些序列代表了克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、腸桿菌屬（Enterobacter）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）和泛菌屬（Pantoea）的物種，以及大小在9,300和379,000個堿基的質粒，這讓研究團隊能夠鑒定潛在的傳播事件。

研究人員發(fā)現(xiàn)，根據共同的遺傳特征，2012-2013年僅有1個病例可與2011年的爆發(fā)直接關聯(lián)。相反，研究結果表明，許多碳青霉烯耐藥性質粒是在各中心獨立引入的，與早期感染沒有明確的流行病學。讓人意外的是，序列數(shù)據還說明耐藥質粒很少發(fā)生水平轉移。

研究人員也在嘗試模擬醫(yī)院生物膜的情況，以便弄清楚哪些情況可能會促使含KPC的質粒轉移到一個新的微生物宿主。

研究人員還在繼續(xù)對新入院的患者以及重癥監(jiān)護室和其他病房中的患者進行積極監(jiān)控。

對于目前的研究，每個樣本的測序價格大約是1200美元，但Segre指出，一旦所有質粒的完整參考基因組都產生，還是能夠在高通量的短讀取儀器上開展更經濟的測序。