本試劑盒僅供研究使用
zui低檢測限：1 ng/ml
特異性：本試劑盒可同時檢測小鼠MPO-ANCA （IgG），且與其他相關(guān)抗體無交叉反應(yīng)。
有效期：6個月
預(yù)期應(yīng)用：ELISA法半定量測定小鼠血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中MPO-ANCA （IgG）含量。
說明
1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。
2．濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
3．中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn)。
4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。
實驗原理
用MPO-ANCA抗原包被酶標(biāo)板，制成固相載體。向微孔中先加入待測樣品進(jìn)行反應(yīng)，然后再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記抗小鼠IgG進(jìn)行反應(yīng)，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的MPO-ANCA （IgG）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品中抗體的效價（抗血清zui終能顯色的zui高稀釋倍數(shù)記為效價）。
試劑盒組成及試劑配制
1.         酶聯(lián)板（Assay plate ）：一塊（96孔）。
2.         樣品稀釋液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶。
3.         辣根過氧化物酶標(biāo)記抗小鼠IgG稀釋液 （HRP-anti-mouse IgG Diluent）：1×10ml/瓶。
4.         辣根過氧化物酶標(biāo)記抗小鼠IgG（HRP-anti-mouse IgG）：1×120μl/瓶（1：100）。
5.         底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。
6.         濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
7.         終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
 
需要而未提供的試劑和器材
1.         標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀
2.         高速離心機
3.         電熱恒溫培養(yǎng)箱
4.         干凈的試管和Eppendof管
5.         系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器
6.    蒸餾水，容量瓶等
標(biāo)本的采集及保存
1.         血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時或室溫過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2.         血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3.         細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注：標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項檢測。
標(biāo)本的稀釋原則：
首先通過文獻(xiàn)檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。稀釋的過程中，應(yīng)做好詳細(xì)的記錄。zui后計算抗體效價時，稀釋了“N”倍，標(biāo)本中抗體的效價為“N”。
辣根過氧化物酶標(biāo)記抗小鼠IgG的稀釋原則：
臨用前以辣根過氧化物酶標(biāo)記抗小鼠IgG稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根過氧化物酶標(biāo)記抗小鼠IgG加990μl辣根過氧化物酶標(biāo)記抗小鼠IgG稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。
操作步驟
實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。
1.         加樣：分別設(shè)空白孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，余孔加待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。
2.         棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記抗小鼠IgG工作液 100μl（取1μl生物素標(biāo)記抗體加99μl生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制），37℃，60分鐘。
3.         溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。
4.         依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見孔內(nèi)有明顯藍(lán)色，即可終止）。
5.         依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。
6.         用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測。
注：
1. 用戶在初次使用試劑盒時，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。
2. 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。
3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。
4. 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請于2-8℃保存。辣根過氧化物酶標(biāo)記抗小鼠IgG工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復(fù)使用已稀釋過的辣根過氧化物酶標(biāo)記抗小鼠IgG工作液。
5. 建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
計算
為檢測樣品中MPO-ANCA （IgG）效價，客戶可以采取樣品2倍倍比稀釋樣品計算抗體效價，一般采取以1:40為起始稀釋倍數(shù)（使用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋）。zui大稀釋倍數(shù)根據(jù)客戶自身試驗要求而定，zui終顯色與陰性對照孔進(jìn)行比較，有明顯差異的zui大稀釋度定為抗體的zui終效價。
注意事項
1. 當(dāng)混合蛋白溶液時應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。
2. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
3. 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4. 如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。
5. 在配制檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。
6. 底物請避光保存。
7. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。