本試劑盒僅供研究使用

特異性：本試劑盒可檢測牛甘膽酸，且與其他相關(guān)物質(zhì)無交叉反應(yīng)。
有效期：6個月
預(yù)期應(yīng)用：ELISA法定量測定牛血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中甘膽酸含量。
說明
1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。
2．濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
3．中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn)。
4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。
實(shí)驗(yàn)原理
本試劑盒采用酶聯(lián)免疫間接競爭法檢測甘膽酸。微孔板上包被有甘膽酸偶聯(lián)物。加入甘膽酸抗體和甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，游離甘膽酸與微量反應(yīng)板上的甘膽酸結(jié)合物競爭結(jié)合抗甘膽酸抗體，沒有結(jié)合的抗體被洗去，再向微孔中加辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，與結(jié)合在反應(yīng)板上的抗體作用一定時間，洗去多余的辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗。再向反應(yīng)孔中加入相應(yīng)反應(yīng)底物TMB，作用一定時間后，結(jié)合的酶結(jié)合物將TMB轉(zhuǎn)化為藍(lán)色，轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的甘膽酸呈負(fù)相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
試劑盒組成及試劑配制
1. 已包被甘膽酸偶聯(lián)物的酶聯(lián)板（Assay plate ）：一塊（96孔）。
2. 標(biāo)準(zhǔn)品（Standard）：2×250ul/瓶。
3. 樣品稀釋液（Sample Diluent）：2×20ml/瓶。
4. 甘膽酸單克隆抗體：1×60μl/瓶（1：100）
5. 辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（HRP-anti-antibody ）：1×120μl/瓶（1：100）
6. 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。
7. 濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
8. 終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
需要而未提供的試劑和器材
1. 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀
2. 高速離心機(jī)
3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱
4. 超聲清洗器
5. 離子交換小柱（PCX）
6. 氮?dú)獯蹈蓛x
7. 干凈的試管和Eppendof管
8. 系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器
9. 蒸餾水，容量瓶等
標(biāo)本的稀釋原則：
首先通過文獻(xiàn)檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，檢測的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。稀釋的過程中，應(yīng)做好詳細(xì)的記錄。zui后計算濃度時，稀釋了“N”倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。
標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：2瓶，每瓶濃度為1000 ng/ml，以樣品稀釋液做系列倍比稀釋，分別稀釋1000 ng/ml，500 ng/ml，250 ng/ml，125 ng/ml，62.5 ng/ml，31.2 ng/ml，15.6 ng/ml。樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ng/ml。
甘膽酸抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗的稀釋原則：
臨用前以樣品稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（甘膽酸抗體每孔50ul，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗每孔100ul），實(shí)際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10ul甘膽酸抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗加990ul樣品稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。
操作步驟
實(shí)驗(yàn)開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。
1. 酶聯(lián)板使用前用洗液洗板2-3次，每次浸泡1-2分鐘，250ul/每孔，甩干。
2. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00ul，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品50ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，然后在所有孔中加入50 ul 膽酸抗體工作液。盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)30分鐘（為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液）。
3. 溫育后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，250ul/每孔，甩干。
4. 所有孔中加入100 ul辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗工作液。盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)30分鐘
5. 溫育后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，250ul/每孔，甩干。
6. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，一般10-15分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的后3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，前3-4孔顏色不明顯，即可終止）。
7. 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。
8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測。
注：
1. 用戶在初次使用試劑盒時，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。
2. 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。
3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。
4. 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請于2-8℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品、甘膽酸抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、甘膽酸抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗工作液。
5. 建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。
計算
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。
注意事項
1. 當(dāng)混合蛋白溶液時應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。
2. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
3. 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4. 請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。
5. 如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。
6. 在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。
7. 底物請避光保存。
8. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。