反應(yīng)效率視為實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析設(shè)計(jì)和優(yōu)化的關(guān)鍵因素。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(通過對(duì)目標(biāo)模板進(jìn)行連續(xù)梯度稀釋獲得) 獲取效率值。該效率值可作為總反應(yīng)的“健康”標(biāo)志。低效率與高效率所造成的影響有所不同。改善上述兩種情形的步驟則相差甚遠(yuǎn)。理想的反應(yīng)效率為100%，但反應(yīng)效率在90–110% 范圍內(nèi)都是可以接受的。
確定某個(gè)特定的分析效率是否低下的方法是稀釋模板生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(模板稀釋的范圍應(yīng)涵蓋所有未知樣本)，然后查看該范圍內(nèi)的效率。它應(yīng)盡可能接近100%。熔解曲線出現(xiàn)多個(gè)峰或凝膠顯示多種產(chǎn)物意味著反應(yīng)源物質(zhì)之間存在競爭作用，這必將對(duì)反應(yīng)效率產(chǎn)生影響。一旦確定反應(yīng)被抑制或效率較低，則可采取一些步驟將效率值重新調(diào)整到理想范圍內(nèi)。
1、對(duì)于抑制作用，可去除模板濃度zui高的反應(yīng)孔并重新分析標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果效率重新回到110% 以下，則分析良好。
2、另一種解決方案是重新純化模板。切記應(yīng)延長干燥時(shí)間，以去除乙醇沉淀過程中的乙醇，或采用另外的柱上洗滌液將離液鹽從硅膠純化物中去除。
3、通過分析優(yōu)化可解決效率低下的問題。此過程有時(shí)相對(duì)簡單，但在某些情況下，隨著分析復(fù)雜度的提高，優(yōu)化過程可能十分耗時(shí)費(fèi)力。
4、擴(kuò)增單個(gè)產(chǎn)物時(shí)，將鎂的濃度提升至6mM 可提高反應(yīng)效率，但當(dāng)出現(xiàn)競爭作用時(shí)，則應(yīng)降低鎂的濃度。
5、在某些情況下(主要是多重反應(yīng)中)，必須采用引物和探針優(yōu)化基質(zhì)。此時(shí)，需檢測正向引物與反向引物的比值或濃度，有時(shí)甚至還需檢測探針比值，以找出分析的理想濃度組合。引物濃度介于100至600nM之間，而探針濃度則在100nM至400nM 之間。
6、根據(jù)引物的Tm 值，確保熱循環(huán)條件(尤其是退火溫度)適當(dāng)，且引物設(shè)計(jì)時(shí)使之有相似的Tm 值。
