【原理】
利用吸附柱提取RNA作為模板，在反轉錄酶的作用下，以引物為起點合成與RNA 模板互補的cDNA鏈；然后在DNA 聚合酶的作用下，經(jīng)高溫變性、低溫退火和中溫延伸的多次循環(huán)，使特異DNA 片段的拷貝數(shù)放大數(shù)百萬倍。將擴增的DNA 片段進行電泳、染色后，在紫外燈下，肉眼可見DNA 片段的擴增帶。
【試劑盒組份】
| 1. 生理鹽水 | 20mL | 8. 吸附柱和收集管 | 10套 |
| 2. 裂解液 | 6mL | 9. 0.2 mL 薄壁PCR 管 | 15個 |
| 3. 洗滌液A | 7mL | 10. RT-PCR 反應液A | 180μL |
| 4. 洗滌液B | 7mL | 11. RT-PCR 反應液B | 50μL |
| 5. 洗脫液 | 500μL | 12. 50 倍TAE 電泳緩沖液 | 20mL |
| 6. 陰性對照 | 300μL | 13. 染色液 | 10μL |
| 7. 陽性對照 | 300μL | | |
注：塑料袋內(nèi)試劑（陽性對照、RT-PCR反應液A和B）-20 ℃凍存，裂解液2-8℃冷藏，其他室溫保存。
【操作方法】
一、樣品制備
1 樣品采集：病死或撲殺的禽，取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織；待檢活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物，置于50%生理鹽水中，2～8 ℃保存。（要求送檢病料新鮮，嚴禁反復凍融。）
2 樣品處理：
2.1 組織樣品的處理：稱取組織0.1g于研磨器中磨碎，再加1mL生理鹽水繼續(xù)磨至無塊狀物；然后將樣品轉至1.5 mL滅菌離心管中，8000 rpm離心2 min，取100 µL上清于1.5 mL 滅菌離心管中。
2.2 全血樣品的處理：待血凝后取100 µL血清于1.5 mL 滅菌離心管中。
2.3 陽性對照的處理：取陽性對照 100 µL于1.5 mL 滅菌離心管中。
2.4 陰性對照的處理：取陰性對照100 µL于1.5 mL 滅菌離心管中。
二、病毒RNA的提取
1. 取已處理的樣品、陰性對照和陽性對照，分別加入450µL裂解液，充分顛倒混勻，室溫靜置3min 。
2. 加入275µL無水乙醇，輕輕混勻。
3. 將混合液吸入吸附柱中（吸取液體時盡量不要吸到懸浮雜質(zhì)，以免離心時堵塞吸附柱），10,000 rpm 離心1min，棄去收集管中液體，套回收集管。
4. 向吸附柱中加入500µL洗滌液A，10,000 rpm 離心1min，棄去收集管中液體，套回收集管。
5. 向吸附柱中加入500µL洗滌液B，10,000 rpm 離心1min，棄去收集管中液體，套回收集管。
6. 空柱10,000 rpm 離心2 min。
7. 將吸附柱移入新的無RNA酶的1.5 mL離心管中，在膜*加入30µL洗脫液，室溫靜置2min，10,000 rpm 離心1min，獲得總RNA。
三、RT-PCR
1. 反應體系：分別取14µL RT-PCR反應液A（用前混勻）、4µL RT-PCR反應液B（用前混勻）和2µL模板RNA，混勻。
2. 反應程序：在PCR儀上運行以下程序：42 ℃ 45 min，94 ℃ 3 min ；94 ℃ 30 s 、53℃ 30 s 、72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。
四、電泳
1. 制膠：用50倍稀釋的TAE電泳緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠。
2. 電泳：待膠凝固后，取5µL PCR擴增產(chǎn)物點樣于瓊脂糖凝膠孔中，以5V/cm的電壓于50 倍稀釋的TAE 電泳緩沖液中電泳。
3. 染色：取50 倍稀釋的TAE 電泳緩沖液30mL，加入10µL染色液，混勻后將膠浸泡30min，于紫外燈下觀察結果。
【結果判斷】
陽性對照出現(xiàn)400bp擴增帶，陰性對照無帶出現(xiàn)（引物帶除外）時，實驗結果成立。被檢樣品出現(xiàn)400bp擴增帶為禽流感病毒陽性，否則為陰性。
【需用但未提供的材料】
組織研磨器、眼科剪、*、一次性注射器、瓊脂糖、經(jīng)焦碳酸二乙酯（DEPC ）處理的滅菌1.5mL 離心管和吸頭（10 µL、200 µL、1000 µL）。
【注意事項】
1．本試劑盒有效期為6個月，不要使用超過有效期限的試劑，試劑盒之間的組分不要混用。
2．所有試劑應在規(guī)定的溫度儲存，使用時拿到室溫下，使用后立即放回。
3．注意防止試劑盒組分受污染。使用前將塑料袋內(nèi)試劑瞬離15s，使液體全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液體時移液器吸頭盡量在液體表面層吸取。
4．嚴格按試劑盒說明書操作可以獲得的結果。操作過程中移液、定時等全部過程必須精確。
5．RNA提取過程中，應戴口罩、勤換手套，盡量縮短操作時間。
6．所有接觸病料的物品均應合理處理，以免污染實驗室。
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