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MicroRNA
點(diǎn)擊次數(shù)：1191 發(fā)布時(shí)間：2013-8-20
MicroRNA的概念
MicroRNA（miRNA）是一類內(nèi)生的、長度約20-24個(gè)核苷酸的小RNA,是發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個(gè)堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成。其在細(xì)胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用。每個(gè)miRNA可以有多個(gè)靶基因，而幾個(gè)miRNAs也可以調(diào)節(jié)同一個(gè)基因。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可以通過一個(gè)miRNA來調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)，也可以通過幾個(gè)miRNAs的組合來精細(xì)調(diào)控某個(gè)基因的表達(dá)。隨著miRNA調(diào)控基因表達(dá)的研究的逐步深入，將幫助我們理解高等真核生物的基因組的復(fù)雜性和復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。miRNA廣泛存在于真核生物中，是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA，其本身不具有開放閱讀框（ORF）。成熟的miRNA，5′端有一個(gè)磷酸基團(tuán)，3′端為羥基。編碼miRNAs的基因zui初產(chǎn)生一個(gè)長的pri-RNA分子，這種初期分子還必須被剪切成約70-90個(gè)堿基大小、具發(fā)夾結(jié)構(gòu)單鏈RNA前體（pre-miRNA）并經(jīng)過Dicer酶加工后生成。成熟的miRNA 5’端的磷酸基團(tuán)和3´端羥基則是它與相同長度的功能RNA降解片段的區(qū)分標(biāo)志。miRNA 5'端*個(gè)堿基對U（尿苷）有強(qiáng)烈的傾向性，而對G卻排斥，但第二到第四個(gè)堿基缺乏U。一般來講，除第四個(gè)堿基外，其他位置堿基通常都缺乏C。這些分子能夠與那些和它的序列互補(bǔ)的mRNA分子相結(jié)合，有時(shí)候甚至可以與特定的DNApian斷結(jié)合。這種結(jié)合的結(jié)果就是導(dǎo)致基因的沉默。這種方式是身體調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一個(gè)重要策略。據(jù)推測，miRNA調(diào)節(jié)著人類三分之一的基因。
MicroRNA形式
1. pre-miRNA
約70bp含microRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的pre-miRNA。
制備方式：化學(xué)合成、生物轉(zhuǎn)錄合成、pre-miRNA質(zhì)粒表達(dá)載體、pre-miRNA病毒。
2. pri－miRNA
天然pri－miRNA
從染色體基因文庫中調(diào)取300bp－1000bp完整的microRNA基因，克隆到質(zhì)粒載體（普通載體或病毒載體），以強(qiáng)大的CMV啟動(dòng)子操縱該300bp－1000bp microRNA。
人工pri－miRNA
選擇一個(gè)完整的microRNA基因，克隆到質(zhì)粒載體（普通載體或病毒載體）。以人工合成的約70bp含miRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的目標(biāo)pre-RNA替代原pre-RNA，并以pol Ⅱ/pol III 啟動(dòng)子操縱該microRNA結(jié)構(gòu)單元。
的形式
的作用方式
miRNA基因是一類高度保守的基因家族，按其作用模式不同可分為三種：*種以線蟲lin-4為代表，作用時(shí)與靶標(biāo)基因不*互補(bǔ)結(jié)合，進(jìn)而抑制翻譯而不影響mRNA的穩(wěn)定性（不改變mRNA豐度），這種miRNA是目前發(fā)現(xiàn)zui多的種類；第二種以擬南芥miR-171為代表，作用時(shí)與靶標(biāo)基因*互補(bǔ)結(jié)合，作用方式和功能與siRNA非常類似，zui后切割靶mRNA；第三種以let-7為代表，它具有以上兩種作用模式：當(dāng)與靶標(biāo)基因*互補(bǔ)結(jié)合時(shí)，直接靶向切割mRNA，如果蠅和Hela細(xì)胞中l(wèi)et-7直接介導(dǎo)RISC分裂切割靶mRNA；當(dāng)與靶標(biāo)基因不*互補(bǔ)結(jié)合時(shí)，起調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用，如線蟲中的let-7與靶mRNA3´端非翻譯區(qū)不*配對結(jié)合后，抑制調(diào)節(jié)基因的翻譯。
MiRNA的特異性
研究表明MiRNAs在物種間具有高度的保守性、時(shí)序性和組織特異性——在特定的時(shí)間、組織才會表達(dá)。
細(xì)胞特異性或組織特異性是miRNA表達(dá)的主要特點(diǎn)，又如擬南芥中的miR-171僅在其花序中高水平表達(dá)，在某些組織低水平表達(dá)，在莖、葉等組織中卻無任何表達(dá)的跡象；20-24h的果蠅胚胎提取物中可發(fā)現(xiàn)miR-12，卻找不到miR3-miR6，在成年果蠅中表達(dá)的miR-1和let-7也無法在果蠅胚胎中表達(dá)，這同時(shí)體現(xiàn)了miRNA的又一特點(diǎn)——基因表達(dá)時(shí)序性。MiRNA表達(dá)的時(shí)序性和組織特異性暗示miRNA的分布可能決定組織和細(xì)胞的功能特異性，也可能參與了復(fù)雜的基因調(diào)控，對組織的發(fā)育起重要作用。
siRNA是RNAi途徑的主要作用物,miRNA和siRNA很容易混淆，他們有許多共同點(diǎn)也有許多不同點(diǎn)。為了能夠清楚地讓讀者弄清兩者之間的差異之處，筆者特別將它們之間的差別劃分入三個(gè)大的階段：起源階段、成熟階段和功能階段（即調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用階段）。
在描述兩者的差異之前，有必要先說一說它們的共同點(diǎn)：
1． MiRNA和siRNA都是由22個(gè)左右的核苷組成；
2． 它們都是Dicer酶的產(chǎn)物；
3． 它們在起干擾、調(diào)節(jié)作用時(shí)都會和RISC復(fù)合體結(jié)合；
4． 它們都可以在轉(zhuǎn)錄后和翻譯水平干擾以抑制靶標(biāo)基因的翻譯；
miRNA與近親siRNA的差異
兩者之間的主要差異：
起源階段
SiRNA：通常是外源的，如病毒感染和人工插入的dsRNA被剪切后產(chǎn)生外源基因進(jìn)入細(xì)胞（注：病毒入侵，或者是自身合成RNA中出現(xiàn)錯(cuò)誤，細(xì)胞內(nèi)就會產(chǎn)生雙鏈RNA，來阻止這些異?；虻谋磉_(dá)）。
MiRNA：是內(nèi)源性的，是一種非編碼的RNA；由miRNA基因表達(dá)出zui初的pri-miRNA分子。
成熟過程
SiRNA：直接來源是長鏈的dsRNA（通常為外源）；經(jīng)過Dicer酶*切割形成雙鏈siRNA,而且每個(gè)前體daRNA能夠被切割成不定數(shù)量的siRNApian段。
MiRNA：在細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄的較大的pri-miRNA經(jīng)由Drosha（一種RNAse Ⅲ酶）和Pasha（含有雙鏈RNA結(jié)合區(qū)域）加工成為單鏈pre-miRNA；接著，發(fā)夾狀、部分互補(bǔ)的pre-miRNA在細(xì)胞質(zhì)中被Dicer*（一種RNAse Ⅲ酶）酶切割形成miRNA；在生物體中的表達(dá)具有時(shí)序性、保守性和組織特異性。
功能階段
siRNA：它與RISC*（RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物，使用的AGO蛋白家族的成分為AGO2）結(jié)合，以RNAi途徑行使功能，即通過與序列互補(bǔ)的靶標(biāo)mRNA*結(jié)合（與編碼區(qū)結(jié)合），從而降解mRNA以達(dá)到抑制蛋白質(zhì)翻譯的目的；它通常用于沉默外源病毒、轉(zhuǎn)座子活性。
MiRNA:它和RISC形成復(fù)合體（利用的AGO蛋白家族成員為AGO1）后與靶標(biāo)mRNA通常發(fā)生不*結(jié)合，并且結(jié)合的位點(diǎn)是mRNA的非編碼區(qū)的3’端；它不會降解靶標(biāo)mRNA，而只是阻止mRNA的翻譯； miRNA能夠調(diào)節(jié)與生長發(fā)育有關(guān)的基因。
注：RISC, RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex; RISC）的組裝是在RNAi和miRNA通路中zui為復(fù)雜的過程。新的研究表明，與siRNA和miRNA結(jié)合的RISC復(fù)合物并不*相同其中的AGO蛋白質(zhì)有AGO1和AGO2之分。剛產(chǎn)生的siRNAs和miRNAs都是雙鏈結(jié)構(gòu)，這種雙鏈結(jié)構(gòu)需要解螺旋才能被組裝到RISC中發(fā)揮作用。組裝后的復(fù)合物分別稱為siRISC和miRISC。從dsRNA引發(fā)RNAi的發(fā)生大致劃分為三個(gè)階段，即啟動(dòng)、剪切和擴(kuò)增。
Dicer酶：新的研究表明siRNA成熟需要Dicer-2和R2D2蛋白，而miRNA則依賴Dicer1和它的伴侶loqs蛋白。
選擇方法
1.pre-miRNA是zui早采用的microRNA，擁有大量的成功報(bào)道。化學(xué)合成的pre-miRNA制備快捷，可以標(biāo)記熒光等追蹤。缺點(diǎn)是制備的RNA穩(wěn)定性較差，而且，由于制備的microRNA較長，合成時(shí)RNA的錯(cuò)誤難以避免（當(dāng)合成RNA超過60bp時(shí)，出現(xiàn)一個(gè)堿基錯(cuò)誤率約30％），轉(zhuǎn)錄制備的pre-miRNA穩(wěn)定性較好，但無flank結(jié)構(gòu)，很少使用。質(zhì)粒載體形式的pre－miRNA也因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)microRNA的flank對于microRNA功能和測定非常重要，現(xiàn)已逐漸被pri-miRNA取代。
2.人工pri-miRNA效果較pre-miRNA好，也有足夠多的成功使用的經(jīng)驗(yàn)報(bào)道，但這種人工microRNA采用固定的mir155 flank，制備的microRNA功能不及天然原始microRNA，故也逐漸較少使用。
3.原始天然pri-miRNA克隆自天然文庫的microRNA由于保留了每個(gè)microRNA獨(dú)自的原始天然雙臂結(jié)構(gòu)，效果更好，是近來被方法。
4.pre-miRNA或pri-miRNA腺病毒：可以轉(zhuǎn)染大多數(shù)絕細(xì)胞，產(chǎn)品質(zhì)量可靠。缺點(diǎn)是腺病毒有一定的毒性，以往實(shí)驗(yàn)腺病毒毒性并未引起重視，但我們發(fā)現(xiàn)在microRNA實(shí)驗(yàn)中顯得比較突出。另外，制備周期長，費(fèi)用高也是不容忽視的缺點(diǎn)。
5.慢病毒microRNA：目前的microRNA實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品，缺點(diǎn)是慢病毒自身的不足，即制備lenti－virus時(shí)，病毒的質(zhì)量批間差異較大。
AAV、或retrovirus microRNA：與腺病毒和lenti－virus microRNA一樣，具有病毒產(chǎn)品的優(yōu)勢與缺點(diǎn)。