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上海一基實業(yè)有限公司

血清,蛋白,培養(yǎng)基,生物試劑,清洗機

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技術(shù)文章

磺胺十五合一檢測試劑盒

點擊次數(shù):609 發(fā)布時間:2019-2-19

磺胺十五合一檢測試劑盒使用說明書

 1 原理及用途

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測組織、血清、蜂蜜、牛奶、雞蛋、飼料等樣本中的磺胺類藥物(Sulfonamides,SAs),試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測時,加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液,樣本中的磺胺類藥物和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗磺胺類藥物抗體,加入酶標(biāo)記物后,用TMB底物顯色,樣本吸光度值與其所含磺胺類藥物含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中磺胺類藥物的殘留量。

2 技術(shù)指標(biāo)

2.1 試劑盒靈敏度:0.5ppb(ng/ml)

2.2 反應(yīng)模式:25℃,45min~15min

2.3 檢測下限:

組織(高檢測限方法)……………………0.5ppb

組織(低檢測限方法)……………………5ppb

血清、尿液、雞蛋………………………2ppb

蜂蜜………………………………………0.5ppb

牛奶………………………………………10ppb

飼料………………………………………20ppb

2.4 交叉反應(yīng)率:

 

藥物名稱

交叉率

靈敏度ppb

*(SM2)

100%

0.5

*(SMM)

670%

0.07

*(SMD)

582%

0.09

*(SDM')

451%

0.1

磺胺甲基嘧啶(SM1)

313%

0.15

*(SD或SDZ)

308%

0.15

*(SM2')

241%

0.2

*(SDM)

175%

0.3

磺胺甲噻二唑(SMT)

165%

0.3

*(Esb3)

67%

0.8

*(ST)

58%

0.9

*(SCPA)

58%

0.9

*(SMP)

57%

0.9

磺胺喹噁啉(SQX)

42%

1

*(SIZ)

18%

3

 

 2.5 樣本回收率:

組織、蜂蜜、雞蛋………………………………85±25%

尿樣、牛奶、血清、飼料………………………80±25%

3 試劑盒組成

酶標(biāo)板……………………………96孔

標(biāo)準(zhǔn)液:各1ml

0ppb、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb

高標(biāo)準(zhǔn)液(紅蓋):1ppm…………1ml

酶標(biāo)記物(紅蓋)…………………5.5ml

抗體工作液(藍蓋)………………5.5ml

底物液A(白蓋)……………………6ml

底物液B(黑蓋)……………………6ml

終止液(黃蓋)………………………6ml

20X濃縮洗滌液(白蓋)……………40ml

2X復(fù)溶液(黃蓋)…………………50ml

說明書………………………………1份

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器:酶標(biāo)儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平(感量0.01g)

4.2 微量移液器:單道20µl-200µl,100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑:乙酸乙酯、正己烷、乙腈、Na2HPO4·12H2O、NaOH 、濃HCl、NaH2PO4·2H2O

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知:

實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭,以避免污染干擾實驗結(jié)果。

5.2 配液:

配液1:0.2M  磷酸鹽緩沖液

    稱取25.8g Na2HPO4·12H2O和4.4g NaH2PO4·2H2O加去離子水500ml溶解。

配液2:乙腈-乙酸乙酯溶液

    量取50ml乙腈和50ml乙酸乙酯加入100ml玻璃瓶中,混勻。

配液3:0.5M鹽酸溶液

    4.3ml濃HCL加入去離子水定容至100ml混勻。

配液4:0.2M  NaOH溶液

    0.8gNaOH用去離子水100ml溶解

配液5:復(fù)溶液

    將2×復(fù)溶液用去離子水2倍稀釋,用于樣本的復(fù)溶,復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個月。

5.3 樣本前處理步驟:

5.3.1 組織樣本高檢測限處理方法

1)稱取2±0.05g均質(zhì)組織樣本置離心管中,加入1ml 0.2M磷酸鹽緩沖溶液,用渦旋儀渦動樣本成糊狀,加入7ml乙腈-乙酸乙酯溶液,振蕩2min,室溫4000r/min以上離心5min;

2)移取4ml上層清澈有機相至干燥容器中,在50-60℃氮氣或空氣吹干;

3)加入1ml正己烷溶解干燥的殘留物,加入樣本復(fù)溶液1ml。振蕩混合30s,室溫4000r/min以上離心5min;

4)去除上層正己烷,取50µl下層水相用于分析。  

    樣本稀釋倍數(shù):1    檢測下限:0.5ppb

5.3.2 組織樣本低檢測限處理方法

1)稱1.0±0.05g 均質(zhì)組織樣本于離心管中;加入9ml 0.2M PB緩沖液,震蕩5min,室溫4000r/min以上離心5min; 

2)取50µl上層液體用于分析。

    樣本稀釋倍數(shù): 10    檢測下限: 5ppb  

5.3.3 雞蛋樣本處理方法

1)用均質(zhì)器均質(zhì)雞蛋樣本,使蛋清和蛋黃充分混合;

2)稱取2.0±0.05g均質(zhì)后的雞蛋樣本(蛋粉1g加3ml去離子水混勻后取2ml相當(dāng)于2g鮮雞蛋)至50ml離心管中,加入8ml乙腈,立即用振蕩器振蕩10min,室溫4000r/min以上離心5min;

3)移取1ml上清液至10ml潔凈干燥玻璃試管中于,在50-60℃氮氣或空氣吹干;

4)加入1ml正己烷,用渦旋儀渦動30s溶解干燥的殘留物,再加入1ml復(fù)溶工作液,用渦旋儀渦動1min,室溫4000r/min以上離心5min;

5)去上層有機相,取下層水相50ul用于分析。

    樣本稀釋倍數(shù): 4    檢測下限:2ppb  

5.3.4 血清樣本處理方法 

1)將血樣本于室溫放置30min,室溫4000r/min以上離心10min,分離出血清或過濾血清;

2)取1ml血清,加入3ml 0.2M PB緩沖液混合,混合30s;

3)取50µl用于分析。  

    樣本稀釋倍數(shù):4    檢測下限:2ppb  

5.3.5 蜂蜜樣本處理方法

1)稱取1±0.05g蜂蜜樣本于50ml離心管中,加入1ml 0.5M鹽酸置于37℃環(huán)境中30min;

2)加入2.5ml 0.2M 氫氧化鈉 (將PH值調(diào)至5左右)再加入4ml乙酸乙脂振蕩5min,4000r/min以上室溫離心5min;

3)取2ml上層液體于50℃下氮氣吹干,加0.5ml 已稀釋好的復(fù)溶液復(fù)溶,混合30s;

4)取50µl用于分析。  

    樣本稀釋倍數(shù):1    檢測下限:0.5ppb

5.3.6 尿樣本處理方法

1)用3ml 0.2M PB緩沖液與1ml經(jīng)離心后的清亮尿樣本混合,混合30s; 

2)取50µl液體用于分析。  

    樣本稀釋倍數(shù): 4    檢測下限:2ppb 

5.3.7 牛奶樣本處理方法

1)取100ul牛奶樣本用0.2M PB緩沖液按1︰19(v/v)稀釋(即100ul牛奶+1.9ml 0.2M PB緩沖液),混合30s;

2)取50µl用于分析。  

    樣本稀釋倍數(shù):20    檢測下限:10ppb     

5.3.8 飼料樣本處理方法

1)稱取2.0±0.05g飼料樣本至50ml聚苯乙烯離心管中,加入8ml乙腈,振蕩5min,室溫4000r/min以上離心5min;

2)移取1ml上層有機相至10ml潔凈干燥玻璃試管中,在50-60℃氮氣或空氣吹干;

3)加入1ml正己烷,用渦旋儀渦動30s,再加入1ml 0.2M磷酸鹽緩沖溶液,用渦旋儀渦動30s混勻,轉(zhuǎn)入2ml聚苯乙烯離心管中,室溫4000r/min以上離心5min;

4)除去上層有機相,移取100ul下層水相至2ml離心管中,加入 900ul 0.2M磷酸鹽緩沖溶液,用渦旋儀渦動1min,混勻;

5)取50ul用于分析。

   樣本稀釋倍數(shù):40    檢測下限:20ppb

6 酶聯(lián)免疫試驗步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出,置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解,每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架,將不用的微孔板放入自封袋,保存于2-8℃。

實驗開始前,用去離子水將20×濃縮洗滌液按20倍稀釋成工作洗滌液。

6.1 編    號:將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號,每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應(yīng):加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中,然后加酶標(biāo)記物50µl/孔,再加入50µl/孔的抗體工作液,用蓋板膜封板,輕輕振蕩5秒混勻,25℃反應(yīng)45分鐘。

6.3 洗    滌:小心揭開蓋板膜,將孔內(nèi)液體甩干,用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次,每次間隔30秒,用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。

6.4 顯    色:每孔加入底物液A 50µl,再加底物液B 50µl,輕輕振蕩5秒混勻,25℃避光顯色15分鐘。

6.5 終    止:每孔加入終止液50µl,輕輕振蕩混勻,終止反應(yīng)。

6.6 測吸光值:用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值(建議用雙波長450/630nm)。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計算

    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以個標(biāo)準(zhǔn)液(0ppb)的吸光度值,再乘以100%,即

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