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磺胺十五合一檢測試劑盒
點擊次數(shù)：609 發(fā)布時間：2019-2-19
磺胺十五合一檢測試劑盒使用說明書
1 原理及用途
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測組織、血清、蜂蜜、牛奶、雞蛋、飼料等樣本中的磺胺類藥物（Sulfonamides，SAs），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，樣本中的磺胺類藥物和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗磺胺類藥物抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含磺胺類藥物含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中磺胺類藥物的殘留量。
2 技術(shù)指標(biāo)
2.1 試劑盒靈敏度：0.5ppb(ng/ml)
2.2 反應(yīng)模式：25℃，45min～15min
2.3 檢測下限：
組織（高檢測限方法）……………………0.5ppb
組織（低檢測限方法）……………………5ppb
血清、尿液、雞蛋………………………2ppb
蜂蜜………………………………………0.5ppb
牛奶………………………………………10ppb
飼料………………………………………20ppb
2.4 交叉反應(yīng)率：
藥物名稱 | 交叉率 | 靈敏度ppb |
*（SM2） | 100% | 0.5 |
*（SMM） | 670% | 0.07 |
*（SMD） | 582% | 0.09 |
*（SDM'） | 451% | 0.1 |
磺胺甲基嘧啶（SM1） | 313% | 0.15 |
*（SD或SDZ） | 308% | 0.15 |
*（SM2'） | 241% | 0.2 |
*（SDM） | 175% | 0.3 |
磺胺甲噻二唑（SMT） | 165% | 0.3 |
*（Esb3） | 67% | 0.8 |
*（ST） | 58% | 0.9 |
*（SCPA） | 58% | 0.9 |
*（SMP） | 57% | 0.9 |
磺胺喹噁啉（SQX） | 42% | 1 |
*（SIZ） | 18% | 3 |
2.5 樣本回收率：
組織、蜂蜜、雞蛋………………………………85±25%
尿樣、牛奶、血清、飼料………………………80±25%
3 試劑盒組成
酶標(biāo)板……………………………96孔
標(biāo)準(zhǔn)液：各1ml
0ppb、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb
高標(biāo)準(zhǔn)液（紅蓋）：1ppm…………1ml
酶標(biāo)記物（紅蓋）…………………5.5ml
抗體工作液（藍蓋）………………5.5ml
底物液A（白蓋）……………………6ml
底物液B（黑蓋）……………………6ml
終止液（黃蓋）………………………6ml
20X濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml
2X復(fù)溶液（黃蓋）…………………50ml
說明書………………………………1份
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl
4.3 試劑：乙酸乙酯、正己烷、乙腈、Na2HPO4·12H2O、NaOH 、濃HCl、NaH2PO4·2H2O
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結(jié)果。
5.2 配液：
配液1：0.2M 磷酸鹽緩沖液
稱取25.8g Na2HPO4·12H2O和4.4g NaH2PO4·2H2O加去離子水500ml溶解。
配液2:乙腈-乙酸乙酯溶液
量取50ml乙腈和50ml乙酸乙酯加入100ml玻璃瓶中，混勻。
配液3：0.5M鹽酸溶液
4.3ml濃HCL加入去離子水定容至100ml混勻。
配液4：0.2M NaOH溶液
0.8gNaOH用去離子水100ml溶解
配液5：復(fù)溶液
將2×復(fù)溶液用去離子水2倍稀釋，用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個月。
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 組織樣本（高檢測限）處理方法
1）稱取2±0.05g均質(zhì)組織樣本置離心管中，加入1ml 0.2M磷酸鹽緩沖溶液，用渦旋儀渦動樣本成糊狀，加入7ml乙腈-乙酸乙酯溶液，振蕩2min，室溫4000r/min以上離心5min；
2）移取4ml上層清澈有機相至干燥容器中，在50-60℃氮氣或空氣吹干；
3）加入1ml正己烷溶解干燥的殘留物，加入樣本復(fù)溶液1ml。振蕩混合30s，室溫4000r/min以上離心5min；
4）去除上層正己烷，取50µl下層水相用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：1 檢測下限：0.5ppb
5.3.2 組織樣本（低檢測限）處理方法
1）稱1.0±0.05g 均質(zhì)組織樣本于離心管中；加入9ml 0.2M PB緩沖液，震蕩5min，室溫4000r/min以上離心5min；
2）取50µl上層液體用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 10 檢測下限： 5ppb
5.3.3 雞蛋樣本處理方法
1）用均質(zhì)器均質(zhì)雞蛋樣本，使蛋清和蛋黃充分混合；
2）稱取2.0±0.05g均質(zhì)后的雞蛋樣本（蛋粉1g加3ml去離子水混勻后取2ml相當(dāng)于2g鮮雞蛋）至50ml離心管中，加入8ml乙腈，立即用振蕩器振蕩10min，室溫4000r/min以上離心5min；
3）移取1ml上清液至10ml潔凈干燥玻璃試管中于，在50-60℃氮氣或空氣吹干；
4）加入1ml正己烷，用渦旋儀渦動30s溶解干燥的殘留物，再加入1ml復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦動1min，室溫4000r/min以上離心5min；
5）去上層有機相，取下層水相50ul用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 4 檢測下限：2ppb
5.3.4 血清樣本處理方法
1）將血樣本于室溫放置30min，室溫4000r/min以上離心10min，分離出血清或過濾血清；
2）取1ml血清，加入3ml 0.2M PB緩沖液混合，混合30s；
3）取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：4 檢測下限：2ppb
5.3.5 蜂蜜樣本處理方法
1）稱取1±0.05g蜂蜜樣本于50ml離心管中，加入1ml 0.5M鹽酸置于37℃環(huán)境中30min；
2）加入2.5ml 0.2M 氫氧化鈉 (將PH值調(diào)至5左右)再加入4ml乙酸乙脂振蕩5min，4000r/min以上室溫離心5min；
3）取2ml上層液體于50℃下氮氣吹干，加0.5ml 已稀釋好的復(fù)溶液復(fù)溶，混合30s；
4）取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：1 檢測下限：0.5ppb
5.3.6 尿樣本處理方法
1）用3ml 0.2M PB緩沖液與1ml經(jīng)離心后的清亮尿樣本混合，混合30s；
2）取50µl液體用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 4 檢測下限：2ppb
5.3.7 牛奶樣本處理方法
1）取100ul牛奶樣本用0.2M PB緩沖液按1︰19（v/v）稀釋（即100ul牛奶+1.9ml 0.2M PB緩沖液），混合30s；
2）取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：20 檢測下限：10ppb
5.3.8 飼料樣本處理方法
1）稱取2.0±0.05g飼料樣本至50ml聚苯乙烯離心管中，加入8ml乙腈，振蕩5min，室溫4000r/min以上離心5min；
2）移取1ml上層有機相至10ml潔凈干燥玻璃試管中，在50-60℃氮氣或空氣吹干；
3）加入1ml正己烷，用渦旋儀渦動30s，再加入1ml 0.2M磷酸鹽緩沖溶液，用渦旋儀渦動30s混勻，轉(zhuǎn)入2ml聚苯乙烯離心管中，室溫4000r/min以上離心5min；
4）除去上層有機相，移取100ul下層水相至2ml離心管中，加入 900ul 0.2M磷酸鹽緩沖溶液，用渦旋儀渦動1min，混勻；
5）取50ul用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：40 檢測下限：20ppb
6 酶聯(lián)免疫試驗步驟
將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
實驗開始前，用去離子水將20×濃縮洗滌液按20倍稀釋成工作洗滌液。
6.1 編 號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)記物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應(yīng)45分鐘。
6.3 洗 滌：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6.4 顯 色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘。
6.5 終 止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。
6.6 測吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。
7 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計算
標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以個標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即