Amplite NADP+/NADPH檢測試劑盒 增強(qiáng)靈敏度是美國AAT Bioquest研發(fā)的檢測總NADP和NADPH的試劑盒，煙X胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和煙X胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的兩種重要的輔因子。 NADH是NAD +的還原形式。 NAD形成NADP，通過酯鍵將磷酸基團(tuán)添加到腺苷核苷酸的2'位置。傳統(tǒng)的NAD / NADH和NADP / NADPH測定基于監(jiān)測340nm處NADH或NADPH吸收的變化。 NAD / NADH和NADP / NADPH測定的短紫外波長使得傳統(tǒng)方法具有低靈敏度和高干擾。 AAT Bioquest的Amplite™比色總NADP / NADPH檢測試劑盒為檢測總NADP和NADPH提供了一種便捷的方法。系統(tǒng)中的酶特異性識別酶循環(huán)反應(yīng)中的NADP / NADPH。無需從樣品混合物中純化NADP / NADPH。酶循環(huán)反應(yīng)顯著提高了檢測靈敏度。 NADPH探針是一種生色傳感器，在NADP減少時(shí)具有460nm的大吸光度。 NADPH探針的吸收與溶液中NADPH的濃度成正比。 Amplite™比色總NADP和NADPH分析試劑盒提供靈敏的分析，可在100μL分析體積中檢測低至0.03μM的總NADP / NADPH。與試劑盒＃15260相比，該試劑盒具有更高的靈敏度。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的Amplite NADP+/NADPH檢測試劑盒 。

實(shí)驗(yàn)方案

96孔板檢測示例

概述

準(zhǔn)備NADP / NADPH反應(yīng)混合物（50μL）

加入NADPH標(biāo)準(zhǔn)品或測試樣品（50μL）

在室溫下孵育15分鐘至2小時(shí)

監(jiān)測460nm處的吸光度

注意：在開始實(shí)驗(yàn)之前，在室溫下解凍每個試劑盒組分中的一個。

操作步驟

1.準(zhǔn)備NADPH原液：

將200μLPBS緩沖液加入到NADPH標(biāo)準(zhǔn)品（組分C）的小瓶中以制備1mM（1nmol / L）NADPH儲備溶液。

注意：未使用的NADPH原液應(yīng)分成單次使用的等分試樣并儲存在-20℃。

2.制備NADP / NADPH反應(yīng)混合物：

2.1將8mL NADPH探針緩沖液（組分B-II）加入到NADP / NADPH回收酶混合物（組分A）的瓶中，并充分混合。

2.2將2 mL NADPH探針（組分B-I）加入上述瓶中（來自步驟2.1）并充分混合。

注意：這種NADP / NADPH反應(yīng)混合物足以進(jìn)行200次分析。未使用的NADP / NADPH反應(yīng)混合物應(yīng)分成一次性等分試樣并儲存在-20℃。

3.準(zhǔn)備NADPH標(biāo)準(zhǔn)品的連續(xù)稀釋液（0至2μM）：

3.1將2L 1mM NADPH儲備溶液（來自步驟1）加入998L PBS緩沖液（pH7.4）中，產(chǎn)生2M（2 pmols / L）NADPH標(biāo)準(zhǔn)溶液。

注意：稀釋的NADPH標(biāo)準(zhǔn)溶液不穩(wěn)定，應(yīng)在4小時(shí)內(nèi)使用。

3.2取200μL2MNADPH標(biāo)準(zhǔn)溶液（來自步驟3.1）進(jìn)行1：2連續(xù)稀釋，得到1，0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0313和0M系列稀釋的NADPH標(biāo)準(zhǔn)品。

3.3如表1和2中所述，將含有NADPH標(biāo)準(zhǔn)品和含NADP / NADPH的測試樣品的系列稀釋液加入白色/透明底96孔微量培養(yǎng)板中。

注意：根據(jù)需要準(zhǔn)備細(xì)胞或組織樣本。為方便起見，裂解緩沖液（組分D）可用于裂解細(xì)胞。 （詳見附錄）。

表1：白色/透明底96孔微孔板中NADPH標(biāo)準(zhǔn)品和測試樣品的布局

注意：NS = NADPH標(biāo)準(zhǔn)，BL =空白對照，TS =測試樣品

表2：每個孔的試劑組成

*注意：將連續(xù)稀釋的NADPH標(biāo)準(zhǔn)品（0.0313μM至2μM）加入NS1至NS7的孔中，一式兩份。 高濃度的NADPH（例如，>30μM，終濃度）將導(dǎo)致飽和信號并使校準(zhǔn)曲線非線性。

4.在上清液反應(yīng)中運(yùn)行NADPH測定：

4.1將50μL的NADP / NADPH反應(yīng)混合物（來自步驟2.2）加入NADPH標(biāo)準(zhǔn)品，空白對照和測試樣品的每個孔中（參見步驟3.3），使總NADP / NADPH測定體積為100μL/孔

注意1：對于384孔板，每孔加入25μL樣品和25μLNADP/ NADPH反應(yīng)混合物。

注意2：根據(jù)需要準(zhǔn)備細(xì)胞或組織樣本。 為方便起見，裂解緩沖液（組分D）可用于裂解細(xì)胞。 （詳見附錄）。

4.2在室溫下孵育反應(yīng)15分鐘至2小時(shí)，避光。

4.3用吸光度讀板儀在460 nm處檢測吸光度的增加。