熒光顯微鏡是監(jiān)測細胞生理狀態(tài)的重要工具。熒光顯微鏡最關鍵的特性是能夠在黑暗背景下照亮熒光物體，這些物體可能非常微弱，若無此技術則難以檢測。為了優(yōu)化熒光，必須盡可能Z大化圖像的亮度和分辨率。為了區(qū)分目標熒光和視野中的其他物體，使用濾光片組合來觀察特定的激發(fā)光達到樣品中的熒光團。

對熒光顯微鏡的理解,重要的是要了解熒光本身的基礎過程。熒光涉及熒光指示劑吸收光能(即光子)的過程,隨后在僅僅幾納秒內發(fā)射部分光能(作為另一個光子)。在這個過程中,會損失一部分能量,所以發(fā)射的光子擁有比吸收光子更低的能量。熒光指示劑發(fā)射的光通常會具有比激發(fā)光更長的波長。熒光顯微鏡原理上是通過將發(fā)射光與激發(fā)光分離開來,從而將樣本中的暗部和亮部分離出來。

圖1.顯微鏡的基本組成部分和熒光成像的光路。不同于單一的光路，有兩個或多個濾光鏡與激發(fā)光和發(fā)射光波長相關,位于目標鏡前后。圖像由BioRender制作。

影響熒光顯微鏡的三個常見因素:亮度、分辨率和維護

亮度

圖像的總亮度將影響熒光是否容易被檢測和拍攝。樣品必須提供足夠的光能量來激發(fā)每個附著在樣品上的染色體所需要的波長。適當濾光器的選擇將有助于最大限度地將發(fā)射的熒光導向觀察或相機管,同時阻止不需要的波長。因此,汞燈或氙燈是理想的燈源,因為它們能量高,將提供大量 Needed熒光激發(fā)能量來適當照亮樣品。

此外，物鏡有助于從樣本中收集光線，并直接影響觀察到的圖像的亮度強度。建議使用具有高質量色差校正的物鏡，以幫助產(chǎn)生更清晰的圖像。物鏡還應設計成在接近紫外線波長的光照射下不會自發(fā)熒光。油浸物鏡可以用來幫助減少由于光線在玻璃載玻片和/或蓋玻片表面反射而導致的光損失。盡管熒光顯微鏡制造商試圖制造全部包含自發(fā)熒光組件的顯微鏡，但這仍然應該被考慮在內。

分辨率

合適的蓋玻片也有助于提高圖像分辨率。蓋玻片的厚度不等，通常在0.01至0.03毫米之間，顯微鏡物鏡應該進行微調以適應這些變化。有時，購買精度非常高的蓋玻片是確保物鏡校正始終以最佳狀態(tài)進行的最佳途徑。

物鏡應該定期使用適當?shù)娜軇┻M行清潔，大約每個月一次。任何多余的油都有可能吸附灰塵，這將降低生成圖像的質量和分辨率。在為油浸物鏡選擇油時，確保油不含PCB，幾乎不自發(fā)熒光，且在物鏡與蓋玻片接口使用時不會形成氣泡。

維護

操作顯微鏡的人應該秉持以下原則:

1.保持所有光學元件全部無塵,清潔,防止油脂,溶劑或任何其他可能的污染物。

2.顯微鏡應存放在煙霧盡量少、環(huán)境盡可能清潔、振動少或為零、通風系統(tǒng)空氣流動平穩(wěn)的房間內。

3.當不使用時應給顯微鏡蓋上罩子,所有附屬組件盡可能保存在防塵密閉容器內存儲。

注意：標準各不相同，但通常最佳做法是盡量減少接觸。最重要的是細致對待,以很大程度地避免損壞,校準問題及其他可避免的問題。

4.不應使用腐蝕性溶劑清潔儀器的任何部分，稀釋的肥皂水通常是好的清潔劑。在清潔物鏡前，應先使用壓縮氣體除去松散的灰塵和顆粒。內部鏡片上的污垢應由專業(yè)人員清除，因此聯(lián)系制造商將了解下一步的操作。對于外部鏡片和其他容易接觸的組件，溫和而持續(xù)的清潔和維護可以延長熒光顯微鏡的使用壽命。

5.清潔鏡頭時一定要非常輕柔,因為即使是鏡頭紙也可能在鏡面的表面產(chǎn)生極細的劃痕。鏡頭清潔布是常見的選擇。有許多專門用于光學表面清洗的溶劑,但必要時也可以用乙醇替代。蒸餾水也常被選用。值得注意的是,其他溶劑可能會與鏡片上產(chǎn)生化學反應的涂層。例如,氨常被證明會破壞防反射涂層。丙酮也可能對塑料部件產(chǎn)生損害,所以清洗時需要小心。

注意:清潔鏡片時,首先用清潔劑或乙醇浸濕棉簽,輕輕擦拭鏡片表面幾遍,每擦一次都要轉動棉簽,以防粉塵再次沾染上表面。

圖2.清洗外部顯微鏡鏡片去除污跡的有效方法。好的做法是由中心向外進行輕輕圓周型律動,而不是隨機或不穩(wěn)定的移動,否則可能會漏洗部分區(qū)域或者造成損壞。圖示由BioRender制作。

熒光顯微鏡故障處理技巧

應盡可能防止光漂白，因為這會對樣本造成損害?？梢酝ㄟ^向樣本添加抗褪色試劑、使用特殊介質，減少樣本暴露于光下的時間來實現(xiàn)。減少這種曝光包括減少總體光強度或在不觀察或拍攝樣本時，使用顯微鏡照明器中的濾光片滑塊或快門阻擋激發(fā)光的方法。

如果在制片前清洗染色后的樣本以去除過多的熒光物質，也可以限制樣本的自發(fā)熒光。

雖然透明膠片可能因其能提供增強的對比度和色彩飽和度而更受青睞，但日光平衡透明膠片可能有助于提供樣本顏色、分辨率或對比度的最佳呈現(xiàn)。

建議和預防措施

 表一.不斷增加的媒體注意事項

1.理想情況下所有顯微鏡觀察都應在黑暗房間內進行,對熒光顯微鏡來說這一點尤其重要。因為人眼很難快速適應黑暗,而熒光信號比較弱時,眼睛就很難在黑暗中辨別細微的熒光變化。

2當選擇適合顯微鏡的組件時,建議選擇一款配有玻璃或石英透鏡的目標物鏡。這種鏡頭材料在近紫外光區(qū)域具高透明度。

3.使用低放大倍數(shù)的投影鏡將有助于限制圖像的總放大倍數(shù)。

4.對比反射式熒光光學成像,總體來說采用透射式熒光時成像效果較差。不過,如果采用透射式,使用暗場造片機可以有助于改善成像質量。

注意:選擇合適的光圈濾膜也有助于優(yōu)化樣品中熒光素的對比度。關鍵是這些濾膜需要匹配樣品的熒光激發(fā)和二級熒光特性。

最佳的光源選擇是氙氣燈和汞蒸氣燈，或者可以精確調節(jié)到特定波長的激光燈。

對任何類型的熒光顯微鏡來說,在照明源和熒光濾鏡之間加入一個隔熱濾鏡都非常重要。這能有效限制可能造成的過熱損害。

當燈具開始閃爍,或者樣品的部分區(qū)域明暗不均時,很可能就是時候更換光源了。

圖3.U2OS細胞經(jīng)過1小時的Calcein AM孵育后固定于含2%甲醛的96孔黑色板內。去除全部培養(yǎng)基后加入防褪色染料。使用熒光顯微鏡與相同的曝光設置對0秒和30秒的FITC信號強度進行比較。