通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行 PBMC（外周血單核細(xì)胞） 分析可廣泛應(yīng)用于研究和臨床研究，包括 HIV 研究、癌癥免疫治療和基于細(xì)胞因子的免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)研究。PBMCs通常通過(guò)密度梯度離心或磁珠分離從外周血、骨髓和臍帶中提取。這些方法旨在將白細(xì)胞與紅細(xì)胞 (RBC) 等其他細(xì)胞成分分離。

流式細(xì)胞術(shù)的一個(gè)常見應(yīng)用是 PBMC 免疫表型分析。該技術(shù)測(cè)量被稱為“分化簇"(CD) 標(biāo)記的細(xì)胞表面分子的表達(dá)，以識(shí)別、區(qū)分和表征 PBMC 亞群。除了 CD 標(biāo)記表達(dá)之外，計(jì)數(shù)和細(xì)胞大小的精確監(jiān)測(cè)對(duì)于該分析也至關(guān)重要。其中一個(gè)例子是嵌合抗原受體 T (CAR-T) 細(xì)胞癌癥免疫治療領(lǐng)域。

為了表征 PBMC 上的 CD 標(biāo)記，將針對(duì) CD 標(biāo)記的抗體與藻紅蛋白 (PE) 等熒光團(tuán)綴合。然后使用流式細(xì)胞儀測(cè)量熒光強(qiáng)度，以量化 CD 標(biāo)記表達(dá)水平并區(qū)分 PBMC 亞群。本應(yīng)用說(shuō)明演示了用于表征 PBMC 上 CD 標(biāo)記的單熒光團(tuán)和雙熒光團(tuán) PBMC 染色技術(shù)。

CD45 抗體和小鼠 IgG 綴合物的制備

材料：

· 1.Buccutite™ 快速 PE 抗體標(biāo)記試劑盒（貨號(hào) 1310）

注意：試劑盒足以進(jìn)行 2 次標(biāo)記反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng) 100 µg 抗體

· 2.Buccutite™ 快速 APC 抗體標(biāo)記試劑盒（貨號(hào) 1311）

注意：試劑盒足以進(jìn)行 2 次標(biāo)記反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng) 100 µg 抗體

· 3.1X PBS 緩沖液 (pH 7.2 – 7.4)

· 4.4 個(gè) 2 mL 洗滌管

· 5.4 個(gè) 1.5 mL 收集管

· 6.離心機(jī)

所有 CD45 抗體和小鼠 IgG 綴合物均使用以下應(yīng)用說(shuō)明制備：

· Buccutite™ 快速藻膽蛋白抗體偶聯(lián)

CD45 抗體和小鼠 IgG 綴合物的濃度：

使用 Buccutite™ 快速藻膽蛋白抗體偶聯(lián)應(yīng)用說(shuō)明和 Buccutite™ 快速抗體標(biāo)記試劑盒（貨號(hào) 1310 和 1311）制備的 CD45 和小鼠 IgG 偶聯(lián)物的濃度如下：

PBMC的制備

冷凍保存的PBMC解凍并制備如下：

材料：

1.人類PBMC（冷凍保存，1000萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/瓶）

2.血細(xì)胞培養(yǎng)基

3.胎牛血清

4.15mL錐形管

5. 離心機(jī)

6. 吸管

制備方法

1. 收到冷凍的 PBMC 后，立即解凍細(xì)胞并開始培養(yǎng)，以保持最高的細(xì)胞活力。

2. 要解凍細(xì)胞，請(qǐng)將小瓶放入 37°C 水中，輕輕攪拌約 1 分鐘。

a. 注意：將蓋子遠(yuǎn)離水以盡量減少污染風(fēng)險(xiǎn)。

3. 將細(xì)胞移入含有 10% 胎牛血清的 10 mL 新鮮血細(xì)胞培養(yǎng)基的 15 mL 錐形管中。

a. 注意：總體積 = 10.1 mL（100 µL PBMC + 9 mL 新鮮血細(xì)胞培養(yǎng)基 + 1 mL 胎牛血清）

4. 在室溫下以 1,000 rpm (~220g) 離心 5 分鐘。

5. 取出上清液，細(xì)胞即可使用。

PBMC 的單熒光團(tuán)和雙熒光團(tuán)染色：

前兩節(jié)中制備的綴合物和 PBMC 用于以下細(xì)胞表面免疫標(biāo)記方案。

材料：

· 1.PBMC

· 2.HHBS 緩沖液（ 貨號(hào) 20011）

· 3.測(cè)定緩沖液（含 1% BSA 的 HHBS 緩沖液）

· 4.臺(tái)盼藍(lán)鈉鹽*超純級(jí)*（ 貨號(hào) 2452）

· 5.TruStain FcX™CD45 – PE 結(jié)合物

· 6.CD45 – APC 綴合物

· 7.CD4 – FITC 綴合物

· 8.CD3 – APC 綴合物

· 9.小鼠 IgG – PE 綴合物

· 10.小鼠 IgG – APC 綴合物

· 11.NovoCyte 3000 流式細(xì)胞儀

PBMC 染色：

1. 在免疫標(biāo)記之前，使用臺(tái)盼藍(lán)染料排除測(cè)試（2452）確定 PBMC 活力，每個(gè)樣品使用 100 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。

2. 用 HHBS 緩沖液（ 20011）通過(guò)離心機(jī)以 1000 RPM 洗滌 PBMC 2 次，每次洗滌 5 分鐘。

3. 為了阻斷非特異性 Fc 介導(dǎo)的相互作用，將 PBMC 重懸于含有 1% BSA 溶液的 HHBS 緩沖液和 Human TruStain FcX™ 5 µL/100 µL 檢測(cè)緩沖液中，并在室溫10分鐘。

4. 對(duì)于單熒光團(tuán) PBMC 染色，將 PBMC 與終濃度 0.1 µg 的 CD45-PE、CD45-APC、小鼠 IgG-PE 或小鼠 IgG-APC 在冰上避光孵育 20 分鐘。

5. 對(duì)于雙熒光團(tuán) PBMC 染色，將 PBMC 與 CD45-PE 和 CD4-FITC 以及 CD45-PE 和 CD3-APC 共孵育。所有四種染料的終濃度均為 0.5 µg，在冰上避光保存 20 分鐘。

6. 用 Assay Buffer 清洗 PBMC 兩次，然后將 PBMC 重懸于 Assay Buffer 中。

7. 在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析。

使用 Buccutite™ 綴合技術(shù)生成的綴合物可提供高質(zhì)量的產(chǎn)量。這些綴合物在 PBMC 上進(jìn)行了測(cè)試，并且可以靈活地與其他綴合物組合進(jìn)行多色染色，以檢測(cè) PBMC 中的 CD 標(biāo)記。

使用 CD45-PE、CD45-APC、CD4-FITC 和 CD3-APC 使用單熒光團(tuán)和雙熒光團(tuán)對(duì) PBMC 進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。密度圖（最左邊）用于從其他細(xì)胞群中排除淋巴細(xì)胞。直方圖（右上）和密度圖（右下）分別用于單次和多次熒光團(tuán)染色。數(shù)據(jù)記錄在 ACEA Biosciences 的 NovoCyte 3000 流式細(xì)胞儀上，并使用 NovoExpress 1.2.5 版進(jìn)行分析。