胱天蛋白酶的熒光FMK肽抑制劑被廣泛用于檢測活細(xì)胞中的胱天蛋白酶活性，但該技術(shù)有一些嚴(yán)重的局限性：a）FMK半胱天冬酶抑制劑具有很高的細(xì)胞毒性，因?yàn)镕MK肽與活性胱天蛋白酶共價(jià)結(jié)合。 b）FMK肽與caspase的不可逆共價(jià)結(jié)合會抑制caspase活性，導(dǎo)致假陽性凋亡。 C） FMK分析具有高的背景，并且需要大量洗滌，從而導(dǎo)低的通量。 d）FMK肽在水溶液中不穩(wěn)定，必須立即使用。 ApoSight Green Caspase 3/7底物可以用96孔或384孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并易于適應(yīng)自動化。下面我們一起來了解該產(chǎn)品的實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)過程吧。

適用儀器

流式細(xì)胞儀

Ex:             488 nm 激發(fā)

Em:             530/30 nm 濾波片

通道：                FITC通道

熒光顯微鏡

Ex:                 FITC濾波片組

Em:             FITC濾波片組

推薦板孔：          黑色透明底板

實(shí)驗(yàn)方案

樣品實(shí)驗(yàn)方案

簡要概述

1.使用96孔板的密度為5×104至2×105細(xì)胞/ 100 µL /孔的待測化合物制備細(xì)胞
2.加入等體積的ApoSight Caspase 3/7底物工作溶液
3.在5％CO2培養(yǎng)箱中于37°C孵育60分鐘
4.用HHBS洗滌細(xì)胞1-2次
5.使用帶有530/30 nm濾波片（FITC通道）的流式細(xì)胞儀或帶有FITC濾波片組的熒光顯微鏡分析細(xì)胞

溶液配制

1.儲備溶液配制

所有未使用的儲備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲存在-20°C下。 避免重復(fù)凍融循環(huán)。

ApoSight Green Caspase 3/7底物儲備液（200X）
在ApoSight 綠色胱天蛋白酶3/7底物瓶中加入50 µL DMSO，制成200X ApoSight 綠色胱天蛋白酶3/7底物原液。
注意，一次性使用等分試樣，以避免重復(fù)的凍融循環(huán)。

2.工作溶液配置

ApoSight Green Caspase 3/7底物工作溶液

在ApoSight 綠色胱天蛋白酶3/7底物瓶中加入50 µL DMSO，制成200X ApoSight 綠色胱天蛋白酶3/7底物原液。
注意，一次性使用等分試樣，以避免重復(fù)的凍融循環(huán)。

樣品示例及操作

懸浮培養(yǎng)中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的實(shí)例

1.用2μg/ mL喜shu堿處理Jurkat細(xì)胞3小時(shí)
2.用1μM星形孢菌素處理Jurkat細(xì)胞3-4小時(shí)
3.用4μg/ mL喜shu堿處理HL-60細(xì)胞4小時(shí)
4.用1μM星形孢菌素處理HL-60細(xì)胞4小時(shí)。
注意，應(yīng)對每個細(xì)胞系進(jìn)行單獨(dú)評估，以確定誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞密度。

熒光顯微鏡的樣品方案

1.用5×104至2×105個細(xì)胞/ 100 µL /孔/ 96孔板的密度制備含待測化合物的細(xì)胞。
2.向細(xì)胞中加入等體積的Caspase 3/7底物工作溶液（100 µL /孔/ 96孔板）。
3.在5％CO2培養(yǎng)箱中于37°C孵育60分鐘。
4.用HHBS或您選擇的緩沖液洗滌細(xì)胞1-2次。
5.使用FITC濾波片組的熒光顯微鏡成像。

流式細(xì)胞術(shù)的樣品方案

1.以1：200的比例將200 X ApoSight Green Caspase 3/7底物原液添加到細(xì)胞溶液中，并在5％CO2培養(yǎng)箱中于37°C孵育細(xì)胞60分鐘。
注意，用于ApoSight Green Caspase 3/7底物標(biāo)記的細(xì)胞可濃縮至約5 X 106細(xì)胞/ mL。適當(dāng)?shù)姆跤龝r(shí)間取決于所用的單個細(xì)胞類型和細(xì)胞濃度。
2.使用530/30 nm濾波片（FITC通道），通過流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度。
注意，要增加信號/背景比，請以約200 g的速度旋轉(zhuǎn)細(xì)胞5分鐘，用1 mL洗滌緩沖液（例如HHBS或所選緩沖液）洗滌細(xì)胞，然后將細(xì)胞重懸至所需的洗滌量。

圖示

圖1.使用ApoSight 綠色胱天蛋白酶3/7底物檢測Jurkat細(xì)胞中胱天蛋白酶3/7活性。將Jurkat細(xì)胞（200,000個細(xì)胞/孔/ 96孔板）用1μM星形孢菌素或DMSO處理4小時(shí)。將細(xì)胞與Caspase 3/7底物工作溶液在37°C下孵育1小時(shí)。使用FITC濾波片組，用熒光顯微鏡拍攝圖像。