活化的核酸內(nèi)切酶引起的核小體間 DNA 斷裂被普遍認為是細胞凋亡的生化標志。含有這些 DNA 鏈斷裂的細胞可以通過末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 dUTP 缺口末端標記(TUNEL)分析來鑒定。這種成熟的原位染色方法依賴于酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(tdT)催化修飾的 dUTPs 與片段化 DNA 的3’-羥基末端的結(jié)合。根據(jù)修飾的 dUTP-BrdUTP，生物S -dUTP 或熒光素 -dUTP- 凋亡細胞的選擇，可以使用各種檢測策略和系統(tǒng)(包括熒光顯微鏡，流式細胞術(shù)和基于熒光的微板研究)來鑒定和測量。百螢提供了幾種熒光 TUNEL 分析方法，優(yōu)化后用于在活細胞或固定細胞和組織樣品中原位檢測細胞凋亡。這些產(chǎn)品可以與其他基于細胞的活力和細胞凋亡測定相結(jié)合，以提供細胞健康的全面評估，評估候選藥物的毒性和安全性，或分析癌癥和疾病相關(guān)的細胞變化。

1.TUNEL分析原理

在細胞凋亡的后期階段，半胱天冬酶激活的核酸內(nèi)切酶將基因組 DNA 切割成寡核小體片段(約180-200堿基對長)。使用 TUNEL 測定，這些斷裂暴露的3’-OH 末端可以用修飾的 dUTPs 標記，以便隨后在原位顯示和定量凋亡細胞。這通常是直接使用染料修飾的 dUTP 或間接使用 BrdUTP 和抗 BrdUTP 的抗體偶聯(lián)物來完成的。無論采用何種標記策略，兩者都需要酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)催化修飾的 dUTPs 與3’-OH 末端的結(jié)合。

圖1.固定化細胞和組織 TUNEL 凋亡顯像檢測細胞凋亡。

用這種方法檢測 DNA 片段需要使用交聯(lián)試劑如4% 多聚甲醛(避免使用乙醇為基礎(chǔ)的固定劑，因為它阻礙了小片段的提取)和樣品透化等樣品固定。這兩個步驟對 TUNEL 檢測是至關(guān)重要的，因為它促進了外源性 TdT 和抗 BrdUTP 抗體偶聯(lián)物的進入。記住幾個變量影響 TUNEL 分析的染色動力學。其中一些變量，包括試劑濃度、樣品固定和 DNA 鏈斷裂的可及性，可能因組織或細胞樣品類型而異。使用具有陽性和陰性凋亡控制樣品的 TUNEL 檢測標準化可以減輕這些潛在的影響并減少假陽性或陰性結(jié)果。

2.活細胞的TUNEL分析

傳統(tǒng)上，TUNEL 分析需要樣品的固定和透化，以促進外源性 TdT 的進入，并確保 DNA 鏈斷裂的成功標記。雖然對結(jié)果至關(guān)重要，這種額外的處理需要額外的手的時間和條件的優(yōu)化，所以結(jié)果是準確的和可重復(fù)的。細胞計數(shù)器活細胞 TUNEL 細胞凋亡測定的目的是確定 DNA 片段沒有酶 TdT 和額外的處理，隨之而來的使用。這些檢測利用了一種專有的膜透性熒光染料，它被動地進入活細胞，并選擇性地靶向在細胞凋亡過程中形成的 DNA 缺口。熒光標記的 DNA 片段可以通過熒光顯微鏡、流式細胞術(shù)或基于熒光的微板分析直接觀察到。Cell MeterTM Live Cell TUNEL 細胞凋亡測定以兩種發(fā)射顏色(綠色和紅色)可用于其他基于熒光的細胞功能測定(例如半胱天冬酶活性測定和膜聯(lián)蛋白 V 染色測定)的多參數(shù)分析中的靈活性。

與未處理的對照相比，用100nM 或1μM 星形孢菌素(SS)處理4小時的 HeLa 細胞中 TUNEL 反應(yīng)的熒光圖像。將細胞與 TUNEL 工作溶液在37 °C 下溫育1小時。紅色熒光信號用 TRITC 濾波器組的熒光顯微鏡進行分析。熒光標記的 DNA 鏈斷裂顯示強烈的熒光染色 SS 處理的細胞。

3. 固定細胞和組織樣品的TUNEL分析

按照傳統(tǒng)的TENL方法,對固定細胞和組織的測定結(jié)果進行了優(yōu)化。 在原地 固定細胞和組織切片細胞凋亡的檢測。這些實驗通過使用TDT催化在片段DNA3'-OH端的染色修飾荷蘭蛋白的結(jié)合,直接識別群體中的凋亡細胞。熒光標記的DNA片段可以分別用熒光顯微鏡或流式細胞儀進行可視化或定量化。細胞儀中的固定細胞和組織TINL細胞凋亡檢測可以用四種發(fā)射顏色(藍色、綠色、紅色和深紅色)進行靈活的多參數(shù)分析,例如其他熒光蛋白或共軛,例如?河豚素 .

主要特征

用于固定細胞和固定組織切片中的凋亡檢測的驗證

通過減少孵化步驟的數(shù)量,直接公司最大限度地減少手的準時性

與其他熒光蛋白和共軛的相容性

化驗結(jié)果為25次試驗提供了足夠的試劑

用細胞計組細胞和組織TINL細胞凋亡測定試劑盒*綠色熒光法測定人肺腺瘤癌切片。DNA鏈斷裂在經(jīng)DNA酶處理的組織切片上顯示出強烈的熒光染色。細胞核染色為核藍色。