膜聯(lián)蛋白V結(jié)合物在Ca2+存在下與凋亡細(xì)胞表面上的PS結(jié)合，它也可以通過(guò)壞死細(xì)胞膜或死細(xì)胞并與細(xì)胞內(nèi)部的PS結(jié)合。 因此，我們建議將細(xì)胞不可滲透的核染色與膜聯(lián)蛋白V結(jié)合物結(jié)合使用，以區(qū)分死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。百螢生物是AAT Bioquest的中國(guó)代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的Annexin V-mFluor Violet 450標(biāo)記探針。 

光譜：

光譜性質(zhì)

　　吸光度(nm)：     406

　　校正因子(260海里)： 0.338

　　校正因子(280海里)： 0.078

　　消光系數(shù)(cm 1米1)：350001

　　激發(fā)：       406 (nm)

　　發(fā)射(nm)：      445

　　量子產(chǎn)率：     0.811

實(shí)驗(yàn)方案

分析方案

概述

用測(cè)試化合物（200μL/樣品）制備細(xì)胞

添加Annexin V結(jié)合物測(cè)定溶液

室溫孵育30-60分鐘

用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡分析

1.用膜聯(lián)蛋白V綴合物制備和孵育細(xì)胞：

1.1制備膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測(cè)定緩沖液：10mM HEPES，140mM NaCl和2.5mM CaCl2，pH 7.4。

1.2用測(cè)試化合物處理細(xì)胞一段所需的時(shí)間（用星形孢菌素處理的Jurkat細(xì)胞4-6小時(shí)）以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

1.3離心細(xì)胞，得到1-5×105個(gè)細(xì)胞/管。

1.4將細(xì)胞重懸于200μL膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測(cè)定緩沖液中（來(lái)自步驟1.1）。

1.5在細(xì)胞中加入2μL膜聯(lián)蛋白V結(jié)合物。

可選：在細(xì)胞內(nèi)加入死細(xì)胞染色劑如碘化丙錠，用于壞死細(xì)胞。

1.6在室溫下孵育30至60分鐘，避光。

1.7在用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡分析細(xì)胞之前，加入300μL膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測(cè)定緩沖液（來(lái)自步驟1.1）以增加體積（參見(jiàn)下面的步驟1.8）。

1.8使用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度（參見(jiàn)下面的步驟2或3）。

2.使用流式細(xì)胞儀分析：

通過(guò)使用具有適當(dāng)過(guò)濾器的流式細(xì)胞儀來(lái)量化膜聯(lián)蛋白V綴合物。

注意：粘附細(xì)胞上的膜聯(lián)蛋白V結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析未經(jīng)常檢測(cè)，因?yàn)樵诩?xì)胞分離或收獲期間可能發(fā)生特定的膜損傷。 然而，Casiola-Rosen等人先前報(bào)道了利用膜聯(lián)蛋白V對(duì)貼壁細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)的方法。 和van Engelend等人（見(jiàn)參考文獻(xiàn)1和2）。

3.使用熒光顯微鏡分析：

3.1移取步驟1.6的細(xì)胞懸液，用膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測(cè)定緩沖液（來(lái)自步驟1.1）沖洗1-2次，然后用膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測(cè)定緩沖液（來(lái)自步驟1.1）重懸細(xì)胞。 將細(xì)胞添加到蓋有玻璃蓋玻片的載玻片上。

注意：對(duì)于粘附細(xì)胞，建議直接在蓋玻片上生長(zhǎng)細(xì)胞。 與膜聯(lián)蛋白V綴合物孵育（步驟1.6）后，用膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測(cè)定緩沖液（來(lái)自步驟1.1）沖洗1-2次，并將膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測(cè)定緩沖液（來(lái)自步驟1.1）加回到蓋玻片中。 在玻璃載玻片上翻轉(zhuǎn)蓋玻片并觀察細(xì)胞。 在與膜聯(lián)蛋白V綴合物孵育后，細(xì)胞也可以在2％甲醛中固定，并在顯微鏡下觀察。

3.2在熒光顯微鏡下用適當(dāng)?shù)臑V光片分析膜聯(lián)蛋白V綴合物的凋亡細(xì)胞

圖1所示。膜聯(lián)蛋白的檢測(cè)綁定活動(dòng)V-mFluor™紫450共軛Jurkat細(xì)胞磷脂酰絲*酸。Jurkat細(xì)胞治療沒(méi)有(綠色)或1μM staurosporine(紅色)為4小時(shí)37oC,然后貼上膜聯(lián)蛋白V-mFluor™紫450共軛30分鐘。熒光強(qiáng)度測(cè)量使用究NovoCyte流式細(xì)胞分析儀在太平洋藍(lán)色通道。