DNA 片段化代表晚期細(xì)胞凋亡的特征。可以通過末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 (TdT) 介導(dǎo)的 dUTP 缺口末端標(biāo)記 (TUNEL) 檢測凋亡細(xì)胞中的 DNA 片段化。TUNEL 測定依賴于 DNA 中缺口的存在，可以通過 TdT 識別，TdT 是一種催化添加 dUTP 的酶，這些 dUTP 用標(biāo)記物進(jìn)行二次標(biāo)記。

TUNEL檢測適用儀器：熒光酶標(biāo)儀、熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀。

問：什么是TUNEL檢測？

答：TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling）檢測是一種用于檢測細(xì)胞凋亡（程序性細(xì)胞死亡）的方法。細(xì)胞凋亡是一種重要的細(xì)胞生物學(xué)過程，它在多種生理和病理情況下發(fā)揮作用，包括發(fā)育、組織修復(fù)和免疫應(yīng)答等。

TUNEL檢測利用一種特殊的酶稱為末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（Terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT），該酶能夠在DNA鏈斷裂的末端附著，并將標(biāo)記有特定標(biāo)記物的dUTP（2'-脫氧尿*啶三磷酸）加到DNA的末端。標(biāo)記物可以是熒光染料、辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）等。

問：為什么要進(jìn)行TUNEL檢測？

答：TUNEL檢測可以用來檢測細(xì)胞凋亡，即程序性細(xì)胞死亡。它在研究細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、免疫學(xué)和疾病研究中都有重要應(yīng)用。通過TUNEL檢測，可以定量評估細(xì)胞凋亡的發(fā)生程度和位置，幫助我們了解細(xì)胞死亡的機(jī)制、疾病的發(fā)生和發(fā)展過程以及治療藥物的療效等。

問：TUNEL檢測與其他細(xì)胞凋亡檢測方法有什么區(qū)別？

答：與其他細(xì)胞凋亡檢測方法相比，TUNEL檢測具有以下優(yōu)點(diǎn)：它可以直接標(biāo)記DNA斷裂的末端，對細(xì)胞內(nèi)凋亡事件的早期和晚期都具有較高的敏感性；它可以提供定量的結(jié)果，可以通過顯微鏡觀察或流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析；它可以用于多種樣本類型，包括細(xì)胞培養(yǎng)、組織切片和血液等。

問：TUNEL檢測的限制是什么？

答：1.假陽性結(jié)果：TUNEL檢測可能存在假陽性結(jié)果的風(fēng)險。某些非凋亡細(xì)胞可能因?yàn)?span style="font-size: 16px; font-family: Calibri;">DNA修復(fù)、損傷或其他原因而呈現(xiàn)陽性反應(yīng)。因此，在解釋TUNEL結(jié)果時，需要結(jié)合其他凋亡標(biāo)記物和細(xì)胞形態(tài)特征進(jìn)行綜合分析。

2.染色方案的特異性：TUNEL染色通常使用標(biāo)記有熒光染料或酶的dUTP探針。選擇適當(dāng)?shù)奶结樅腿旧桨阜浅Ｖ匾?，以確保特異性染色凋亡細(xì)胞。染色條件的優(yōu)化是至關(guān)重要的，以避免背景噪音和非特異性染色。

3.細(xì)胞凋亡的多樣性：細(xì)胞凋亡是一種復(fù)雜的細(xì)胞過程，具有多樣性。TUNEL檢測只能檢測到DNA斷裂的細(xì)胞凋亡，但并不能提供凋亡的詳細(xì)機(jī)制或階段信息。因此，在研究細(xì)胞凋亡時，可能需要結(jié)合其他方法和標(biāo)記物來獲得更全面的信息。

4.實(shí)驗(yàn)條件的標(biāo)準(zhǔn)化：為了得到可比較和可重復(fù)的結(jié)果，TUNEL檢測需要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。這包括探針濃度、反應(yīng)時間、細(xì)胞固定和處理方法等方面的標(biāo)準(zhǔn)化。缺乏標(biāo)準(zhǔn)化可能導(dǎo)致結(jié)果的變異性和可靠性問題。

5.細(xì)胞類型的差異性：不同細(xì)胞類型在凋亡過程中表現(xiàn)出差異，包括凋亡率和凋亡特征。TUNEL檢測可能在不同細(xì)胞類型之間表現(xiàn)出變異性。因此，在進(jìn)行TUNEL實(shí)驗(yàn)時，需要考慮到所研究細(xì)胞類型的特異性。

問：TUNEL檢測的優(yōu)缺點(diǎn)是什么？

答：TUNEL的優(yōu)點(diǎn)是可以在原位檢測完整的單個凋亡細(xì)胞核或凋亡小體，反應(yīng)靈敏度高，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞凋亡測定，并可結(jié)合流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡進(jìn)行定量分析。

TUNEL的缺點(diǎn)是可能出現(xiàn)非特異性標(biāo)記，如高速分裂和增殖的細(xì)胞、支原體污染、TdT反應(yīng)過強(qiáng)等，也可能導(dǎo)致DNA斷裂和熒光信號。此外，TUNEL不能區(qū)分凋亡和壞死細(xì)胞，也不能反映凋亡的早期事件，如磷脂酰絲*酸外翻、線粒體膜電位降低、Caspase激活等。如需要檢測上述問題請使用我們的磷脂酰絲*酸凋亡的檢測（貨號22790）、Annexin V(貨號22829)、Caspase檢測（貨號22795）等。

問：TUNEL檢測中的假陰性是如何產(chǎn)生的？

答：1.DNA暴露不充分：如果切片沒有經(jīng)過適當(dāng)?shù)耐ㄍ柑幚恚缥⒉ㄐ迯?fù)、高壓修復(fù)或蛋白酶K消化，那么DNA斷裂的末端可能被蛋白質(zhì)包裹，無法被TdT酶和標(biāo)記物識別。因此，需要根據(jù)不同的組織和切片厚度選擇合適的通透方法和時間。

2.TdT酶活性降低：如果TdT酶沒有妥善保存或者反復(fù)凍融，那么它的活性可能會降低，導(dǎo)致標(biāo)記效率下降。因此，需要嚴(yán)格按照說明書的要求保存和使用TdT酶，并且盡量避免反復(fù)凍融。

3.標(biāo)記物濃度不足：如果標(biāo)記物的濃度太低，那么可能無法有效地與DNA斷裂的末端結(jié)合，導(dǎo)致染色不明顯。因此，需要按照說明書的推薦比例配制TUNEL反應(yīng)液，并且根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況適當(dāng)調(diào)整標(biāo)記物的濃度。

4.孵育時間不夠：如果孵育時間太短，那么可能無法完成足夠的標(biāo)記反應(yīng)，導(dǎo)致染色不明顯。因此，需要按照說明書的推薦時間進(jìn)行孵育，并且根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況適當(dāng)延長孵育時間。

5.顯色條件不合適：如果使用熒光顯色的方法，那么需要保持切片干燥，以便熒光素牢固地與TdT結(jié)合，并且避免陽光或強(qiáng)光照射，以防止熒光素發(fā)生光漂白。如果使用DAB顯色的方法，那么需要保持切片濕潤，并且控制好顯色時間和強(qiáng)度，以防止背景過高或過低

問：TUNEL會導(dǎo)致細(xì)胞或結(jié)構(gòu)組織的損傷嗎？

答：在某些情況下，TUNEL實(shí)驗(yàn)可能導(dǎo)致細(xì)胞或組織結(jié)構(gòu)的損傷，可能會影響結(jié)果的解讀。為了減少結(jié)構(gòu)損傷，可以選擇適當(dāng)?shù)臉悠饭潭ê吞幚矸椒ǎ?yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，以盡量減少處理時間和染色試劑對樣品的影響。

問：是否可以將TUNEL實(shí)驗(yàn)與免疫染色或熒光染色相結(jié)合？

答：是的，可以將TUNEL實(shí)驗(yàn)與免疫染色或熒光染色相結(jié)合，以同時檢測細(xì)胞凋亡和其他感興趣的分子標(biāo)記。以下是一些常見的免疫染色或熒光染色與TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)合的方法：

1.免疫染色：您可以選擇特定的抗體標(biāo)記來檢測感興趣的蛋白質(zhì)或標(biāo)記細(xì)胞亞群。TUNEL實(shí)驗(yàn)與免疫染色的結(jié)合可以提供凋亡細(xì)胞的標(biāo)識，并確定其所屬的細(xì)胞類型。您可以使用不同的熒光標(biāo)記或酶標(biāo)記的二抗來檢測細(xì)胞凋亡和其他標(biāo)記的信號。(可使用我們的iFluor系列產(chǎn)品進(jìn)行蛋白標(biāo)記)

2.熒光染色：除了免疫染色，您還可以使用其他熒光染料來標(biāo)記細(xì)胞結(jié)構(gòu)或功能。例如，通過與細(xì)胞膜標(biāo)記染料（如細(xì)胞膜標(biāo)記熒光素）結(jié)合，您可以確定細(xì)胞凋亡的位置和形態(tài)特征。此外，通過與線粒體染料（如MitoLite系列染料）結(jié)合，您可以探索線粒體在細(xì)胞凋亡中的作用。